酶处理纯化啤酒酵母β13葡聚糖的研究Word文件下载.docx
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酵母约5.897×
8
kg,目前多被作为普通饲料销售或
生产酵母味素,产品的附加值提高有限,对于其它有
效资源未能很好利用。
因此,国内外对废酵母利用作
了大量的研究
[4-5]
,其主要集中在提取碱不溶性β-
1,3-葡聚糖、回收酒精和提取蛋白、多肽类物质等方
面,但大多是单一产物的研究,对于废酵母的综合利
用却研究较少。
利用现代生物技术和膜技术对啤酒
废酵母充分开发利用,使其中的海藻糖、β-1,3-葡聚
糖和蛋白质得以充分利用,是提高经济效益的有效
途径之一。
本文用木瓜蛋白酶对提取过海藻糖(酵母
细胞液内)的酵母残渣进行处理,在得到纯度和得率
较高的β-1,3-葡聚糖的同时,回收到多肽、氨基酸
含量丰富的蛋白水解液。
1材料与方法
1.1材料
啤酒废酵母:
广西南宁青岛啤酒有限公司;
木瓜
蛋白酶(80万U/g):
南宁庞博生物工程有限公司;
所
有主要试剂均为国产分析纯试剂。
1.2主要仪器
FOSS自动定氮仪:
丹麦福斯集团公司;
贝克曼
超速离心机:
美国贝克曼库尔特有限公司;
旋转蒸发
仪R-205:
瑞士RUCHI公司;
UV-2051PC紫外可见
分光光度计:
日本岛津公司。
1.3方法
1.3.1酵母β-1,3-葡聚糖提取工艺
新鲜啤酒废酵母→O℃絮凝→干燥→超声破
壁→醇提→离心→沉淀→酶解→灭酶→离心→
↓
上清液为蛋白水解液
上清液用于制备高蛋白饲料(含甘露糖)
↑
沉淀→碱溶→离心→沉淀→醇洗、水洗→真空冷冻
干燥→β-1,3-葡聚糖
1.3.2指标测定与分析
用FOSS自动定氮仪测定粗蛋白含量,蒽酮-硫
酸法测定多糖含量
[6]
,直接干燥法测定水分含量
[7]
,
成品的纯度分析采用200nm~400nm紫外分光扫描
和薄层层析法
多糖得率/%=
成品多糖质量
原料质量
×
100%
蛋白质去除率/%=
酶解前蛋白质含量-酶解后蛋白质含量
酶解前蛋白质含量
2结果与分析
2.1酶处理工艺条件的确定
2.1.1酶用量对酵母残渣蛋白质去除率的影响
取酵母残渣5g,加入适量水,分别选取64、112、
160、208和256U/g(底物)添加木瓜蛋白酶,在
pH6.0,60℃恒温下作用4h,研究酶添加量对酵母残
渣蛋白质去除率的影响,结果如图1所示。
由图1显示,酶用量在64U/g~208U/g,残渣中蛋
白质去除率随酶用量的增加而增大,且在208U/g
时,达到了极大值;
当酶用量大于208U/g时,蛋白
质去除率随酶用量的增加而有所下降,这可能是木
瓜蛋白酶具有酶解能力的同时,还具有合成能力,可
把蛋白质水解物再合成蛋白类物质。
故以208U/g的
酶用量为适。
2.1.2pH对酵母残渣蛋白质去除率的影响
在酶用量为208U/g,其它条件不变的条件下,研
究pH值在4~8对酵母残渣蛋白质去除率的影响,
结果如图2所示。
由图2显示,在pH值4~6,蛋白质去除率随pH
值的增大而迅速增大,在pH值为6.0时达到极大值
56.64%;
pH值6.0~8.0时,蛋白质去除率随pH值的
改变而有所降低,说明在pH值4.0~8.0中,有最适
酶解酵母蛋白的pH条件,故选pH6.0酶解最适合。
2.1.3温度对酵母残渣蛋白质去除率的影响
在酶用量为208U/g,pH值为6.0,其它条件不变
的条件下,在40℃~80℃研究温度对酵母残渣蛋白质
去除率的影响,结果如图3所示。
由图3显示,在40℃~50℃,蛋白质去除率随温
度的升高而上升,说明木瓜蛋白酶的活性随温度的
升高而迅速激活;
而蛋白质去除率在50℃~80℃呈现
出先平缓下降后急剧下降的趋势,并且在80℃达到
最小值45.73%,原因是过高的温度导致酶制剂的部
分失活,故50℃下酶解合适。
2.1.4时间对酵母残渣蛋白质去除率的影响
在酶用量为208U/g,pH值为6.0,温度为50℃,
研究酶解4h~12h对酵母残渣蛋白质去除率的影响,
图1酶用量对蛋白质去除率的影响
Fig.1TheInfluenceofEnzymeAmountonProteinRemovalRate
蛋
白
质
去
除
率
%
60
55
50
45
100150200250
用量/(U·
g
-1
)
图2pH对蛋白质去除率的影响
Fig.2TheInfluenceofpHValueonProteinRemovalRate
58
56
54
52
48
pH
45678
图3温度对蛋白质去除率的影
Fig.3TheInfluenceofTemperatureonProteinRemovalRate
4050607080
温度/℃
48第45卷(总第148期)
结果如图4所示。
由图4显示,酶解4~8h,蛋白质去除率随时间
的延长而急剧升高,可能是酵母本身的部分蛋白质
游离出来,首先被迅速酶解;
然后随着时间的延长,
细胞壁中的蛋白质被适量的酶降解;
而在大于8h
后,由于残留在细胞壁中的结合蛋白及其复合物和
多糖物质相结合,很难释放出来,随着酶解时间继续
延长,底物浓度下降,从而使蛋白质去除率趋于稳
定,故酶解8h为适。
2.1.5酶解工艺条件的优化
根据单因素试验进行正交试验,结果见表1。
由表1中结果和极差分析可以看出,影响蛋白质
去除率的各因素的主次顺序为A>
C=D>
B,即酶添加
量>
温度=酶解时间>
pH;
由平均值可以看出,A、B、C、D
因素的最优水平为A
3
、B
、C
2
、D
1
,即酶添加量为208U/g
(底物),pH6.0,温度50℃,酶解时间8h。
利用Matlab6.5
软件进行方差分析,评价各因素对指标的影响程度。
由
表2中结果的方差分析显示,因素A、B、C、D的F值分
别是25.800、1.000、4.591、5.091,FA>
F0.05(2,2)=19,显
著性为显著,其它三个因素均不显著。
综合酶解反应的极差分析和方差分析,优选出实
验方案为A
B
C
D
,此时蛋白质去除率为62.82%,同
时对酶解后的离心上清液进行测定,其蛋白水解液浓
度为0.348g/L(以氮含量计)。
经酶处理后β-1,3-葡聚
糖最终纯度为90.50%,达到了较理想的效果。
2.2碱处理工艺条件的确定
2.2.1NaOH浓度对β-1,3-葡聚糖的影响
取酶解后的酵母残渣5g,加入浓度分别为1%、
1.5%、2%、2.5%和3%的NaOH30mL,70℃加热3h,
考察NaOH浓度对β-1,3-葡聚糖的影响。
由图5所示,随着NaOH浓度的增加,多糖含量
上升迅速的同时,蛋白质含量急速下降,当NaOH浓
度大于2%时,蛋白质含量下降趋于稳定,而多糖含
量达到高点后有所下降。
2.2.2NaOH用量对β-1,3-葡聚糖的影响
取酶解后的酵母残渣5g,分别加入2%NaOH
15
、
30、45、60和75mL,在70℃加热3h,考察NaOH用量
对β-1,3-葡聚糖的影响。
由图6显示,当NaOH用量小于30mL时,蛋白
质含量急速下降,并在30mL达到一个低点1.27%,
随后趋于平稳;
多糖含量在30mLNaOH用量范围内
急速上升,达到极大点79.85%,随后开始迅速下降。
因素偏差平方和自由度F值显著性
酶用量/A107.262225.800
pH/B4.15721.000
温度/℃19.08724.591
酶解时间/D21.16425.091
F0.05(2,2)=19.000
表1正交实验结果
Table.1ResultsofOrthogonalTest
表2正交试验方差分析结果
Table.2ResultsofVarianceAnalysis
实验号
酶用量
/U/g
pH温度/℃时间/h
蛋白质
去除率/%
11125.040849.66
21126.050949.81
31127.0601050.55
41605.0501052.34
51606.060854.23
61607.040949.78
72085.060956.63
82086.0401055.01
92087.050862.82
K
50.00752.87751.49355.570
52.11753.02754.99052.073
58.16354.38353.80352.643
R8.1561.5063.4973.497
马森等:
酶处理纯化啤酒酵母β-1,3-葡聚糖的研究
图4时间对蛋白质去除率的影响
Fig.4TheInfluenceofTimeonProteinRemovalRate
64
62
4681012
时间/h
多
糖
含
量
/
85
80
75
70
65
1.01.52.02.53.0
NaOH浓度/%
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
多糖含量
蛋白质含量
图5NaOH浓度对多糖含量和蛋白质含量的影响
Fig.5TheInfluenceofSodiumHydroxideConcentrationon
PolysaccharidesandProteinContent
图6NaOH用量对多糖含量和蛋白质含量的影响
Fig.6TheInfluenceofSodiumHydroxideAmountonPolysaccharides
andProteinContent
1530456075
NaOH用量/mL
492009年第1期
2.2.3处理温度对β-1,3-葡聚糖的影响
取酶解后的酵母残渣5g,加入30mL2%NaOH,
分别在50、60、70、80和90℃加热3h,考察温度对
β-1,3-葡聚糖的影响。
由图7显示,当温度低于70℃时,随着处理温度
的升高,多糖含量迅速上升,并达极大值,相反,蛋白
质含量却急速下降,很快达到极小点。
但当温度高于
70℃时,蛋白质含量趋于稳定,但多糖含量却下降明
显,这是因为在高温和碱的协同作用下,造成多糖降
解,随离心上清液损失掉。
2.2.4处理时间对β-1,3-葡聚糖的影响
在70℃下分别处理1、3、5、7和9h,考察处理时间对
β-1,3-葡聚糖的影响。
由图8显示,随着处理时间的延长,多糖得率含
量呈现先上升后缓慢下降的趋势,但蛋白质含量先
迅速下降后趋于平稳。
当处理时间超过5小时,蛋白
质含量变化极小,但多糖含量却有明显的下降。
2.3成品的理化性质分析
2.3.1成品的溶解性和颜色反应
成品不溶于水、无水乙醇、无水乙醚,可稳定悬浮
于二甲基亚砜;
与蒽酮反应呈阳性,表明成品为多糖
类化合物;
与碘反应呈阴性,表明成品中不含糖元。
2.3.2成品的紫外光谱分析
由图9表明,成品在260nm和280nm处均无吸
收峰出现,说明其不含有蛋白质和核酸成分,得到了
较纯的多糖。
2.3.2成品的薄层层析
由图10可见,水解产物只在与葡萄糖对应的位
置显示相似的斑点,说明成品的水解产物为葡萄糖,
且不含有甘露糖,即成品为葡聚糖。
3结论
采用酶处理对酵母残渣中β-1,3-葡聚糖进行
纯化,得到纯度较高的β-1,3-葡聚糖的同时,回收
到0.348g/L多肽、氨基酸含量丰富的蛋白水解液,对
于啤酒废酵母的综合利用有一定的指导意义。
对纯
化条件和碱提取条件进行了优化,得到最佳工艺条
件为酵母残渣中添加208U/g底物的木瓜蛋白酶,在
50℃、pH6.0条件下酶解8h,蛋白质去除率可达到
62.82%。
然后用30mL2%NaOH在70℃恒温水浴中
处理5h,真空冷冻干燥后成品得率为11.00%,其中
多糖含量为90.50%,蛋白质含量为1.28%,水分含
量为6.01%。
参考文献:
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海洋大学出版社,2006:
18-19
图9成品的紫外线吸收光谱
Fig.9UltravioletAbsorptionSpectrumofFinishedProduct
A甘露糖(左)B葡萄糖(中)C成品(右)
图10成品的薄层层析
Fig.10ThinLayerChromatographyResultofFinishedProduct
5060708090
处理温度/℃
2.6
2.4
图7处理温度对多糖含量和蛋白质含量的影响
Fig.7TheInfluenceofTreatmentTemperatureonPolysaccharides
吸
光
A
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
200250300350400
波长/nm
95
90
123456789
处理时间/h
3.5
3.0
2.5
1.5
1.0
图8处理时间对多糖含量和蛋白质含量的影响
Fig.8TheInfluenceofTreatmentTimeonPolysaccharidesand
ProteinContent
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