暨南大学分子生物学考研复习题Word格式.docx

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移动基因的发现动摇了基因在染色体上有一固定位置的传统观念。

（3）断裂基因　过去人们一直认为,基因的遗传密码子是连续不断地并列在一起,形成1条没有间隔的完整基因实体。

但后来通过对真核蛋白质编码基因结构的分析发现,在它们的核苷酸序列中间插入有与编码无关的DNA间隔区,使1个基因分隔成不连续的若干区段。

这种编码序列不连续的间断基因被称为断裂基因。

断裂基因先转录为核内不均一RNA,然后经过删除和连接,除去无关的DNA间隔序列的转录物,便形成了成熟的mRNA分子。

（4）假基因这是一种核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同,但却不能合成出功能蛋白质的失活基因。

（5）重叠基因　长期以来,在人们的观念中一直认为同一段DNA序列内,是不可能存在重叠的读码结构的。

但是,随着DNA核苷酸序列测定技术的发展,人们已经在一些噬菌体和动物病毒中发现,不同基因的核苷酸序列有时是可以共用的。

也就是说,它们的核苷酸序列是彼此重叠的,这样的2个基因被称为重叠基因。

它修正了关于各个基因的多核苷酸链是彼此分立、互不重叠的传统观念。

（6）染色体外基因这类基因存在于染色体外，它们的传递不符合孟德尔的分离和自由组合定律。

如线粒体基因、叶绿体基因等。

它们的基因编码细胞其专一的蛋白质并自我复制。

由此可见,随着生物科学的不断发展,人们对基因概念的理解也不断深入。

在世界科学技术日新月异的今天,生物科学将会有更多新的突破性进展,基因的概念不可避免的将会被赋予新的内容。

2．举例解释蛋白质二级结构、超二级结构（MOTIF）、三级结构、DOMAIN和四级结

蛋白质二级结构:

一条多肽链主链原子局部的空间排列。

蛋白质主链的折叠产生由氢键维系的有规则的构象。

α-螺旋：

肽链的某段局部盘曲成螺旋形结构。

α-螺旋的特征是：

①—般为右手螺旋；

②每螺旋包含3.6个氨基酸残基，每个残基跨距为0.15nm，螺旋上升1圈的距离（螺距）为3.6×

0.15=0.54nm；

③螺旋之间通过肽键上的>

C＝O和-NH-间形成氢键以保持螺旋结构的稳定；

④影响α-螺旋形成的主要因素是氨基酸侧链的大小、形状及所带电荷等性质。

超二级结构：

在蛋白质分子中特别是在球状蛋白质分子中经常可以看到由若干相邻的二级结构元件组合在一起，彼此相互作用，形成种类不多的、有规则的二级结构组合，在多种蛋白质中充当三级结构的构件，称为超二级结构。

3种基本组合形式：

αα，βαβ和ββ。

αα常是由2股平行或反向平行的右手螺旋相互缠绕而成的左手卷曲螺旋。

Domain结构域：

多肽链在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是相对独立的紧密球状实体，称为结构域。

最普遍的结构是α/β型结构，它含有一个由α-螺旋包围着的平行或混合β-回折的核。

所有的糖酵解酶都是α/β型结构，许多其他的酶以及结合运输蛋白也是这种结构。

在α/β型结构中，由环区域形成结合裂缝，这些区域虽对结构的稳定无作用，但通常参与结合和催化活性。

MOTIF:

就是在许多转录因子的序列中,存在的负责与DNA结合的共同基序.这些基序通常都很短,仅含一小部分蛋白质结构,还通过与转录复合体的蛋白质之间的相互作用激活转录.如锌指基序,亮氨酸拉链等都是MOTIF。

三级结构：

一条肽链的所有原子的空间排列。

三级结构是在二级结构的基础上由疏水作用和侧链相互作用形成的。

如肌红蛋白的三级结构有8段α-螺旋区每个α-螺旋区含7～24个氨基酸残基，有1～8个螺旋间区肽链拐角处为非螺旋区（亦称螺旋间区），包括N端有2个氨基酸残基，C端有5个氨基酸残基的非螺旋区内部存在一口袋形空穴，血红素居于此空穴中。

四级结构：

几个亚基在三级结构的基础上相互作用所形成的空间结构。

如红细胞内的血红蛋白是由4个亚基聚合而成的，4个亚基两两相同，即含两个α亚基和两个β亚基。

在一定条件下，这种蛋白质分子可以解聚成单个亚基，亚基在聚合或解聚时对某些蛋白质具有调节活性的作用。

3．@解释DNA聚合酶III各亚基的功能。

DNA聚合酶III是合成DNA新链的主要复制酶，全酶含几种组分如下:

一个催化核心，包括α亚基；

一个二聚体成分（τ二聚体）与两个核心相连；

具有进行性（保留在同一模板链而不解离的能力）的成分（β），保持聚合酶在DNA上；

还有一个装载钳（γ），它将进行性的亚基β结合到DNA上。

全酶在DNA上的组装分三个时期：

（1）β二聚体+γ复合体识别引物模板，形成一个前起始复合体。

在此反应中，γ复合体水解ATP并β亚基转到已引发的模板上。

两个β亚基形成一个“滑动钳”与周围的DNA结合并保证进行性。

γ复合体是一个“滑动钳载体”,用水解ATP来催动β与DNA的结合。

（2）与DNA的结合改变了在β与γ复合体结合位置的构象，结果使其对核心酶具有更高的亲合力。

这保证了核心酶的结合，并通过这种改变将核心酶带到DNA上。

核心酶包括α亚基、ε亚基和θ亚基。

α亚基具有基本的DNA合成能力，ε亚基有3’-5’外切核酸酶校正活性，θ亚基可能是组装所需的（核心酶自身的进行性可能很低，但β滑动钳保证其在DNA上的持续功能）。

（3）τ二聚体与核心酶结合，提供与另一个核心酶结合的二聚化功能（与另一β钳联合）。

全酶是不对称的，因为它只有一个γ复合体。

γ复合体负责在每一个亲链DNA加一对β滑动钳。

全酶的每个核心复合体合成一条DNA新链。

滑动钳载体γ是从DNA上卸下β复合体所需要的，γ复合体与合成后随链的核心酶结合，使两个核心酶在从DNA解离下来的能力不同。

这与合成一个先导链（聚合酶与模板保持结合状态）和一个不连续的后随链（聚合酶反复的结合与分开）的需要是一致的。

γ复合体在单个岗崎片段的合成中起了关键作用。

4.阐明RollingCircleReplication。

滚环式复制（rollingcirclereplication）是一种复制方式，复制叉沿环形模板复制一定次数，每个反应中新合成的链将前一反应中合成的链抛出，形成与环状模板链互补的一系列线性序列。

这个过程。

这个过程存在于某些噬菌体的营养复制过程和结合质粒的转移复制过程。

滚环式复制是噬菌体中常见的DNA复制方式。

M13滚环复制过程包括：

（1）M13在宿主内复制形成复制型双链DNA，新合成单链称为负链。

一个由噬菌体基因组编码的蛋白质——A蛋白，在双链DNA正链的特定位点即复制原点产生缺口。

（2）切除原点后，A蛋白质仍与它产生的5’端连接，宿主DNA聚合酶以3’端作为引物，以负链为模板合成新的正链。

（3）运用滚环机制，此刻的3’－OH端延伸为一个新链。

新链围绕着环状负链模板延伸，直到到达原点并代替原点。

（4）在这里A蛋白质与滚环和替代链尾部5’端相连，又转回原点的生长点附近。

（5）A蛋白又能识别原点并进行切割，连接在新切割产生的末端，继续循环。

（6）完成切割后，被替代的正链以环化状态释放。

A蛋白与环化有关。

正链产物3’端和5’端的连接由A蛋白完成，这是每个复制循环末尾A蛋白释放反应的一部分，接着又开始下一个循环。

滚环复制的特点：

（1）是单方向和不对称的半保留复制。

（2）产物是单链，但是可通过互补链的合成转变成双链。

（3）子代分子可能是连环的，即对应于每个单位基因组的相同DNA分子头尾相连。

（4）连环DNA随后被切成于每一单位基因组相对应的小片断。

（5）负链通常保持环状，因而保留有一套完整的遗传信息。

滚环式复制（rollingcirclereplication）是噬菌体中常见的DNA复制方式。

滚环式复制的一个特点是以一条环状单链DNA为模板，进行新的DNA环状分子合成。

噬菌体的双链DNA环状分子先在一条单链的复制起点上产生一个切口，然后以另一条单链为模板不断地合成新的单链。

释放出的新合成的单链或是先复制成双链DNA，被酶切割成单位长度后，再形成环状双链DNA分子；

或是释放出的新合成的单链DNA，先被酶切割成单位长度形成单链环状DNA分子后再复制成双链环状DNA分子。

质粒的滚环式复制有2个步骤：

第一步是前导链的合成。

质粒编码的复制蛋白（Rep）起始子与超螺旋DNA的正起点结合，并提供链特异性及位点特异性缺口。

随着缺口的母链被替换，随着宿主编码的产的参入，前导链的合成不断进行着，当复制复合体到达重构的起点，同一个或另一个Rep分子在质粒DNA上引入一个新的缺口，使替换链从ssDNA形式解放；

第二步是随后链的合成。

这一过程从不同的质粒区域即单链起点起始。

由于前导链和随后链的解偶联，复制是不对称的。

ssDNA的产生是RC质粒的标志。

宿主谱广可能是RC质粒的特征。

5.@阐明端粒结构与端粒酶的功能。

端粒是真核细胞染色体末端的特殊结构，由端粒DNA和与端粒DNA特异结合蛋白组成的核蛋白复合物，不同种类细胞的端粒重复单位不同，但几乎所有端粒序列能写成Cn（A/T）m的一般形式，其中n>

1而m为1-4。

人类端粒由5′TTAGGG3′的重复单位构成，长度在5～15kb范围。

在端粒附近的DNA形成环状，不暴露任何自由末端可能是保持DNA稳定的重要特征。

当端粒（TTAGGG）n的3’单链末端取代了端粒上游区域的相同序列时，将会形成环状，这会把双链区转变成类似D-环的结构，此时一系列的TTAGGG重复被取代形成一个单链区域，并且端粒尾部与同源链配对。

正常的体细胞中，随细胞分裂次数的增加，端粒逐渐缩短端粒的长度与有丝分裂次数相关，所以端粒又有细胞的“有丝分裂钟”之称。

端粒酶是一个大的核糖核蛋白，它含有一个短RNA组分。

端粒酶是逆转录酶，即一种RNA依赖性DNA聚合酶。

端粒酶的主要作用是维持端粒的长度。

蛋白质组分提供逆转录酶催化活性，核酸组分则提供被作用RNA模板，用端粒末端G-T发夹结构的3’-OH作为DNA合成的引物,以RNA为模板合成DNA。

端粒酶所合成的各个重复被加到染色体的末端，但其本身并不控制重复数，其它的蛋白质决定端粒长度。

6.@原核生物启动子所组成的保守序列和终止子特异序列是什么？

TTGACA---TATAAT------起始位点

-35-10

原核生物启动子有4个保守特征：

起始位点、-10区、-35区以及-10和-35区之间间隔距离。

（1）起始位点通常（>

90%）都是嘌呤碱基。

起始位点经常作为CAT序列的中心，但是仅凭这个三联体的保守性还不足构成专有信号。

（2）在起始位点上游，在几乎所有的启动子中都可以发现一个6bp的区域。

六聚物的中心通常靠近起始点上游的10bp，据其位置常被称为-10区。

它的同源序列为TATAT，据推测：

-10序列中开始的高度保守的TA和最后一个几乎完全保守的T是最重要的碱基。

-10区序列的功能是允许复合体由闭合的转变为开放的，A:

T碱基对组成可辅助DNA溶解成为单链。

（3）另外一个保守六聚体是以起始位点上游-35bp为中心的，称-35区。

其共有序列为TTGACA。

-35区序列的功能是为RNA聚合酶的识别提供信号，将-35区序列看作是“识别域”。

（4）在90%启动子中，-35和-10区之间的分隔距离在16到18bp之间。

个别例外的可以小于15或者大于20bp。

尽管间隔区的真实序列并不重要，但其距离大小保持两个位点恰当分隔，从而适合RNA聚合酶的几何结构方面是很重要的。

终止子是终止反应所需的序列，许多终止子需要一个发夹（Hairpin）来形成终止转录RNA的二级结构，

（1）“ρ-依赖型终止子”终止子内部包含能够形成7-20bp长度发夹的回文结构区。

发夹的基底部通常包含一个富含G:

C区，转录单位最末端的连续约6个U残基的区段，这两个特点都是终止所必需的。

（2）“ρ-依赖型终止子”：

终止需要ρ因子的辅助，ρ有ATP酶活性和解旋酶的作用，ρ因子沿RNA的移动比聚合酶沿DNA的速度快，当酶遇到终止位置处的发夹结构时就暂停，如果ρ在此处追赶上，ρ因子能直接在转录泡内接近RNA-DNA杂交链并使其解旋，则终止发生。

7.@RNA聚合酶I识别的启动子包含有哪两个部分？

分别有什么蛋白因子识别？

RNA聚合酶Ⅰ，它存在于核仁内，负责转录编码rRNA的基因。

它负责大多数细胞内RNA的合成。

在人类细胞中，RNA聚合酶I识别的启动子由两个位于起始位点上游的分开启动子成分构成。

核心启动子和上游控制元件，核心启动子位于起始位点周围，从-45延伸到+20，它本身就足以起始转录。

但是，其效率可被位于-180到-107的上游控制元件（UCE）显著提高。

与一般启动子相比，这两个区域都有不寻常的组成，富含G·

C碱基对，而且它们约有85%是一致的。

RNA聚合酶Ⅰ需要两个辅助因子。

上游元件结合因子（UBF1）是一个单链多肽，它先与UCE结合，再与核心启动子。

选择因子（SL1）由4种蛋白质组成，其行为类似细菌的σ因子，它不与启动子特异性地结合，但可以与和启动子特异结合的其它成分相结合，其主要功能是使RNA聚合酶正确的定位在起始位点。

一旦UBF1结合，SL1就可以协同结合到相应的DNA区域。

两个因子都结合后，RNA聚合酶Ⅰ就与核心启动子结合，起始转录。

8.@RNA聚合酶III识别的启动子有哪几类？

其定位因子是什么？

（1）RNA聚合酶Ⅲ，位于核质内，负责合成tRNA和小RNA。

5SRNA和tRNA基因的启动子是内部启动子，它们位于起位点下游。

snRNA（核小RNA）基因的启动子与其它启动子相似，位于起始位点上游。

这两种情况中，启动子的功能元件都是由可被转录因子识别的序列组成，但它反过来指导RNA聚合酶结合。

（2）RNA聚合酶Ⅲ有三种类型启动子的结构，包括两种类型的内部启动子（类型I和类型II），每个都含有两个分开的结构，其中两个短序列元件被一个多变的序列分开。

类型I由boxA序列和一个隔开的boxC序列组成，

类型II由boxA和一个隔开的boxB序列组成。

类型II启动子上的A盒和B盒之间的距离可以变化很大，但两盒不能过近，太近会失去其功能。

我们将在稍后讨论其上游类型的组织结构。

第III类启动子，其被分隔的启动子序列在起始位点上游，有三个上游元件:

Oct—PSE—TATA。

RNA聚合酶Ⅲ在上游启动子的起始可在紧靠起始位点上游的一段短区域内发生，而且该区域只包含TATA元件。

然而，如果具有PSE（近端序列元件）和OCT元件，转录的效率会大大提高。

这些元件的结合因子能够起互相协调作用。

（3）RNA聚合酶Ⅲ启动子的辅助因子在RNA聚合酶之前先与启动子结合。

它们形成前起始复合体指导RNA聚合酶结合。

RNA聚合酶III通过内部启动子起始转录过程中，包含着TFIIIA、TFIIIC、TFIIIB以及聚合酶的依次组装，。

TFⅢA和TFⅢC是装配因子，其作用是帮助TFⅢB结合在正确的位置。

TFⅢB是RNA聚合酶Ⅲ所需要的真正的起始因子，负责RNA聚合酶的正确定位。

在类型I启动子，TFⅢA结合一个包括boxC的序列，而且该结合是TFⅢC结合所需要的，TFⅢC的结合又引发TFⅢB与起始位点周围的一个序列结合。

在类型II启动子，TFⅢC识别boxB，但结合在一个更大的区域包括boxA和boxB，然后招募TFⅢB结合。

对于上游启动子的第III类启动子，TATA元件被一个包含TBP的因子识别，多种转录因子直接识别上游位点形成前起始复合体（包括TBP），此复合体被RNA聚合酶Ⅲ所识别。

9.@RNA聚合酶II识别的启动子含有多种顺式作用因子，请举4例。

RNA聚合酶Ⅱ，位于核质内（细胞核的一部分，不包括核仁），负责合成核不均一RNA（hnRNA），即mRNA的前体。

真核RNA聚合酶II启动子包含着多种顺式作用因子：

基本元件TATA盒，上游元件（如CAAT盒、GC盒，八聚体）以及其他序列元件之间的不同组合。

在任何一个启动子中发现的这些元件在数目上和位置排列方向不同。

（1）TATA盒（集中在-30bp）是启动子最小的成分，对核心启动子的定位有决定性作用。

尽管当TATA盒突变，起始不受阻止，但是起始位点和它通常的精确位置不同。

（2）。

CAAT盒能被多种因子识别，比如说，CAAT盒能和CTF家族中的多种因子相互作用。

不同启动子中的CAAT盒被不同的因子识别。

CAAT盒影响起始效率，GC和CAAT盒好像在两个方向上都能发挥作用，但似乎对启动子的特异性没有直接作用，它的存在加强了启动子的强度。

上游序列元件，很可能通过直接和通用转录因子作用来强化装配成一个起始复合体的效率。

（3）GC盒通常在起始位点上游40-70bp处，GC盒可被SP1因子识别。

GC盒也好像在两个方向上都能发挥作用，影响起始效率

（4）八聚体序列也能被多种因子识别，能增强启动子的转录。

10.@如何实现真核生物一蛋白基因在大肠杆菌细胞中受控、稳定、分泌和高效表达。

答大肠杆菌是高效表达异源蛋白最常用的原核表达系统。

由于每种基因都有其独特的结构、mRNA的稳定性和翻译效率、蛋白质折叠的难易程度，修主细胞蛋白酶对蛋白质的降解等等原因，因此并非每一种基因都能在大肠杆菌中有效表达。

下面浅谈一下实现真核生物一蛋白基因在大肠杆菌细胞中受控、稳定、分泌和高效表达的策略。

首先，要构建有效的表达载体，一种高效的原核表达载体需要包括一个强大并且可以严紧调节的启动子；

一位于翻译起始密码子5’端大约9bp的SD序列；

位于目的基因3’末端的一个高效转录终止子。

除此之外，载体还需要一个复制起点，筛选标记和利于对启动子活性进行严紧调节的基因。

这种调节元件可以插入载体自身，也可以插入宿主的染色体。

其他的元件包括转录和翻译增强子等。

这些元件的作用往往具有基因特异性，因此要根据不同的情况加以取舍。

构建表达载体，需要仔细考虑多种元件的组合，以保证最高水平的蛋白质合成。

a，提高转录水平调控的策略，

（1）选择的启动子要具有适合高水平蛋白质合成的某些特性。

首先启动子的作用要强；

第二，它必须表现最低水平的基础转录活性。

若要求高效的基因表达，最好选用高密度培养细胞和表现最低活性的可诱导和非抑制启动子。

（2）现在已鉴定了一些在E.coli中显著增强异源基因表达的序列，有可能利用增强子来达到超量表达蛋白质的目的（3）虽然转录终止子在表达质粒的构建过程中常被忽略，但有效的转录终止子是表达载体必不可少的元件。

b，提高翻译水平调控的策略

（1）mRNA5’末端的独特结构是mRNA翻译起始效率的最主要决定因素，因此找到通用的有效起始翻译的共同序列能高效起始外源蛋白的翻译。

（2）SD与起始密码子间的距离约为5-13bp，这一距离影响翻译起始的效率，因此在设计载体中要控制好这段距离。

（3）在mRNA的翻译起始区的二级结构在决定基因表达效率方面具有重要作用，使用一些策略使mRNA形成二级结构的可能性最小。

（3）mRNA的快速降解势必影响蛋白质的产生，比如可以通过选用缺乏某些特定RNase如RNaseII或PNPase的宿主菌来提高基因的表达，这将在E.coli高效表达外源基因中有很大作用。

（4）在mRNA中存在终止信号是翻译终止过程必不可少的，在设计表达载体时，通常插入三个终止密码子以防止核糖体的跳跃，在E.coli中偏向于使用UAA密码子。

C,维护真核生物蛋白基因在大肠杆菌细胞稳定性和减少E.coli中重组蛋白裂解的策略

（1）将蛋白质靶向细胞周质或培养基

（2）在较低的温度下培养细菌；

（3）选用蛋白酶缺陷的菌株；

（4）构建N-末端或C-末端融合蛋白；

融合系统能够产生大量的可溶性的融合蛋白，为E.coli中高效表达和纯化重组蛋白提供了极大方便。

（5）将目的基因多拷贝串联；

（6）与分子伴侣共表达（7）替换特定的氨基酸残基以消除蛋白酶裂解位点；

（8）改善蛋白质的亲水性；

（9）优化培养条件，E.coli中的蛋白质产量可以通过高细胞密度培养系统而获得显著提高，

D,提高真核生物蛋白基因在大肠杆菌细胞分泌的策略

（1）将蛋白质分泌到细胞外是人们最期望的一种策略。

因为这样容易纯化目的蛋白质，减少细菌的蛋白酶对目的蛋白质的裂解。

但是，E.coli在正常情况下只有很少量的蛋白质分泌到细胞外。

在大肠杆菌表达系统中，金黄色葡萄球菌A蛋白的信号肽能引导带有E结构域的A蛋白片段或融合产物从细胞质外泌到培养基中，如果能利用可控的强启动子进行A蛋白信号肽引导的基因表达，则有望在蛋白质外泌方面有所突破。

（2）对培养基的特殊操作能明显提高蛋白质释放到培养基中。

例如，在培养基中添加甘氨酸能增强外周质蛋白释放到培养基中，且不引起明显的细菌裂解。

11.请阐述ALTERNATIVESPLICING的生理学意义。

选择性剪接是指同一基因转录形成的初级RNA经过不同的剪切和连接方式形成不同的mRNA的过程。

是mRNA前体加工过程中一个重要的调控机制，它使得可在低遗传值条件下产生高度的蛋白质多样性。

真核生物含有限数目的基因，但是当严格需要时，真核生物通过一系列精确的工具来加工mRNA,产生不同的转录类型。