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2.2水蒸气蒸馏法 以挥发油提取器按中国药典2005年版一部挥发油测定项下法提取挥发油,经无水硫酸钠干燥后得挥发油[8]。
水蒸气蒸馏法的提取过程时间长、温度高、系统开发,其过程易造成热不稳定及易氧化成分的破坏及挥发损失,对部分组分有破坏作用。
2.3超临界CO2萃取法工艺条件为;
压力为20MPa,萃取池温度50摄氏度,萃取时间2h,得淡黄色透明油状物[8]。
超临界CO2萃取压力和萃取时间对香椿子挥发油的得率影响较大。
在一定范围内萃取压力增大,co2密度增加,挥发油的溶解度也相应提高,但是CO2压力过大,传质速度减慢,扩散系数也随之减小,反而不利于进一步的提取。
3药理作用
3.1抗凝血作用 香椿子正丁醇提取物能显著延长急性高凝模型大鼠RT、APTT、PT、TT,并且呈一定的剂量依赖关系,提示香椿子正丁醇提取物对内源性凝血系统及外源性凝血系统均有强大的抑制作用,且对大鼠血浆ATⅢ活性具有明显升高作用,并呈一定的剂量依赖
关系,从而揭示了香椿子正丁醇提取物抗凝血作用机制可能与提高血浆中ATⅢ活性有关[10]。
饶娅琦等在研究中发现,香椿子能显著延长大鼠的活化部分凝血活酶时间(APTT)和大鼠凝血酶时间(TT),这一结果更充分说明了香椿子有较强的抗凝血作用[11]。
李静等研究发现,预先给大鼠服用香椿子正丁醇提取物5、10、20mg/kg,能显著降低大鼠静脉血栓的湿质量和干质量[12];
在体外试验中,药物0.12、0.24、0.48mg/ml可剂量依赖性地抑制凝血酶诱导的血小板内游离钙离子浓度的升高;
在3.84mg/ml剂量时,能降低血小板膜GPⅡb/Ⅲa受体的表达,香椿子正丁醇提取物抗血栓作用的机制可能为:
抑制凝血过程,控制血小板聚集[12]
3.2降血糖作用香椿子多酚能降低糖尿病大鼠血糖,改善肝脏形态。
且高剂量组对肝脏病理学改善效果较好,说明香椿子多酚有可能通过减轻肝脏损害,改善肝脏血糖的代谢,从而发挥降血糖作用[13]。
3.3心脏保护作用香椿子总多酚可以有效降低心肌缺血再灌注大鼠心肌中NF-κBp65mRNA表达,从而抑制ICAM-1,VCAM-1,E-选择素等细胞因子生成,减少内皮细胞与白细胞之间的黏附及炎性放大效应。
此外,香椿子总多酚可以减轻大鼠心肌缺血再灌注时的形态学损伤,减轻炎症细胞浸润。
因此,香椿子总多酚可以减轻大鼠心肌缺血再灌注炎症损伤,对心脏产生保护作用[9]。
3.4对局灶性脑缺血的保护作用香椿子正丁醇提取物可以改善脑缺血再灌注大鼠神经行为学评分、降低脑缺血再灌注大鼠皮质损伤,从而起到神经保护作用。
香椿子正丁醇提取物可减少缺血侧皮质组织MDA和NO的生成、抑制其SOD活力升高,并降低COX-1和TXA2含量。
因此,香椿子正丁醇提取物可通过其抗氧化应激效应以及降低COX-1TXA2含量对大鼠局灶性脑缺血发挥保护作用[14]。
3.5体外抗氧化作用香椿子多酚具有良好的还原能力,对羟基自由基(·
OH)、超氧阴离子自由基(O2-.)、烷氧基(LO·
)和烷过氧基(LOO·
)均有明显的抑制作用,且呈一定的量效关系。
香椿子多酚清除自由基能力比抗坏血酸弱,但是总还原能力强于抗坏血酸。
所以香椿子多酚体外有明显的抗氧化作用[15]。
对机体纤溶系统的影响
纤溶过程是一系列蛋白催化的连锁反应,其主要作用是使体内所产生的局部或一过性的纤维蛋白凝块随时得到溶解,从而防止血栓形成。
在纤溶系统的各组成成分中,最基本和核心的成分是纤溶酶原,而t-PA则是最主要的内源性激活剂和纤溶系统的启动因子,其主要功能是将纤溶酶原精氨酸561-颉氨酸-562处的肽键断裂,使其激活为具有活性的纤溶。
香椿子可以直接刺激纤溶酶原(PLG)的含量增加,可以促进组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)量和活性的增加。
此外,因颈总动脉血栓形成所造成的机体缺血缺氧、肾上腺素、Ca2+、凝血酶增加及栓塞本身等因素都可以刺激t-PA的合成和释放增加,从而导致
PLG的增加。
因此,香椿子可以明显增强大鼠的纤溶活性[16]。
4讨论
4.1陈铁出,罗忠萍等[3-6]已经研究发现了香椿种子含有酚类、鞣质、生物碱、皂苷、甾体、萜类、挥发油及其油脂等活性成分,但目前国内外对香椿子化学成分的研究仅集中在部分成分的提取及测定方面,而对其含量的测定及其他成分的提取和含量测定均未见报道,且在药理作用方面,也只限于总提取物和多酚类化合物的药理作用,而对其鞣质、生物碱、皂苷、甾体、萜类、挥发油及其油脂等活性成分的药理作用也未见报道,因而在这些方面应做出进一步的研究。
4.2由于血小板在正常凝血与血栓形成中起关键作用,所以本文未将香椿子的抗凝血、抗血小板和抗血栓作用分别进行叙述。
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·
2·
研究目标(包括阶段目标、最终目标、预期成果形式及成果水平,社会、经济效益及其推广应用):
阶段目标:
2012.9月开始进行文献的查阅
2012.9-10月基本确立实验方案着手做
2012.10-12月进行前期预实验
2013.1-4月香椿子中总黄酮的提取及含量测定实验
2013.5-8月正交实验测定香椿子总黄酮对大肠杆菌抑菌作用最小浓度
2013.9-10月处理数据、撰写论文和总结报告
最终目标:
1.香椿子的总黄酮提取成功并测定其含量
2.确定了香椿子总黄酮对大肠杆菌的最低抑菌浓度
3.并扩大香椿的药用部位,以期为香椿子抑菌药物的开发和对泌尿系统疾病的治疗奠定基础
预期成果形式及成果水平:
采用相关的技术和优选最佳的方法提取出香椿子总黄酮并测定其含量;
通过正交试验得出香椿子总黄酮抑制大肠杆菌的最低浓度。
社会、经济效益及其推广应用:
香椿为传统药食同源植物,而香椿子并不是常用药用部位,且其化学成分黄酮类化合物的药理学研究也很少报道过,因此,扩大香椿的药用部位方面并对其做出研究很重要。
3·
研究内容(理论基础、研究实验方法、主要技术路线及工艺流程):
理论基础:
香椿子为楝科(meliaceae)香椿属(toona)香椿(T.sinensisvar.schensiana)的果实。
香椿味苦涩、性温,有祛风利湿、止血止痛的功能,《本草纲目》记载:
椿芽治白秃,“取椿、桃、楸叶心捣汁频涂之即可”椿白皮主治痢疾、肠炎、泌尿道感染、便血白带、风湿腰腿痛,香椿叶及嫩枝主治痢疾,香椿子主治胃和十二指肠溃疡、慢性胃炎等。
曾报道过香椿子化学提取成分中含有黄酮类化合物,且去鞣质黄酮类化合物具有抑菌作用。
黄酮类化合物的基本结构特征是22苯基苯并[α]吡喃或黄烷核,包括两个苯环(A和B)通过杂环吡喃环相连(C)(图1)。
根据中央三碳链的氧化程度、B2环连接位置以及三碳链是否构成环状等特点,主要的黄酮类化合物可分为黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇类、花色素、黄烷23,42二醇类、双苯吡酮类、黄烷232醇类、异黄酮类、二氢异黄酮类、查耳酮类、橙酮类以及高异黄酮类等。
黄酮类化合物种类繁多,结构复杂,具有多种药用功效,如提高免疫力、抗癌防癌、改善血管循环、防治血管疾病、抗氧化、清除自由基等。
黄酮类化合物主要通过抑制细菌DNA旋转酶,抑制细菌细胞质膜的功能,抑制细菌能量代谢等方面发挥抑菌功效。
因此我们就以此为依据进行药理学实验,以期得到香椿子中总黄酮提取物对大肠杆菌抑制作用的最低浓度。
研究实验方法:
运用中药鉴定学及药用植物学知识对香椿子进行性状描述及理化鉴别,运用中药化学及分析化学知识对香椿子进行总黄酮的提取与含量测定,运用微生物学原理对大肠杆菌进行细菌培养及抑菌试验以确定香椿子总黄酮对大肠杆菌的最低抑菌浓度。
主要技术路线及工艺流程:
前期的项目调研、文献资料的查询
研
研究目标的确定
香椿子有效成分的研究、抑菌研究
样品收集鉴定
实验方案的设计
预实验
种子生药学研究
初步的成分鉴定
总黄酮的提取方法的建立
正交试验大肠杆菌的抑菌试验
实验数据、数理分析
撰写论文
项目总结汇报
1.1总黄酮的水浴回流提取
准确称取干燥香椿子10.0g
(加入乙醇)
放入圆底烧瓶中
水浴下回流提取后抽滤
(滤液冷却至室温)
用同浓度的乙醇定容至250m,l得香椿子总黄酮提取液。
另外,采用其他提取方法进行正交设计试验
1.2总黄酮提取液的正丁醇萃取法及含量的测定
称取水浴回流提取物2g
加40ml蒸馏水溶解
用200ml水饱和的正丁醇萃取
将正丁醇相减压浓缩
真空干燥,得黄酮粉末,称重
测定总黄酮的浓度
计算产品纯度及产率
3.培养细菌及抑菌试验
培养基:
蛋白胨水培养基,营养肉汤培养基,沙保弱培养基,营养琼脂培养基,混合培养基制备即在蛋白胨水培养基中加入1.0%葡萄糖和1.6%溴甲酚紫指示剂,8MPa高压灭菌20min后冷藏备用。
所有培养基均为实验前临时配制。
比浊管的配制:
取0.5ml浓度为0.048mol/L的BaCl2加到99.5mL0.18mol/LH2SO4中配置成0.5个麦氏浊度的比浊管(相当于细菌数为1.5×
108个/ml),用试管密闭封装备用。
试样液制备:
称取总黄酮粉末1.0g,置于烧杯中,用10ml纯化水溶解,静置后调节PH至7.5,8MPa灭菌20min后4℃保存备用,此时药液浓度相当于1毫升含0.1g总黄酮。
菌液制备:
将大肠杆菌接种至固体培养基上,37℃培养24h,用生理盐水将菌落洗下。
用比浊管对比稀释至0.5麦氏浊度(1.5×
108个/ml),4℃保存备用。
最小抑菌浓度(MIC)的测定:
采用对倍稀释法测定最小抑菌浓度(MIC),操作全部在超净工作台内进行。
注:
在香椿子提取总黄酮对大肠杆菌的抑菌实验过程中可能会出现一些问题,会随时做调整。
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