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端荧光报告基团切下,使其解除了3'
端淬灭基团的淬灭作用而发射荧光。
被释放的荧光信号与PCR产物成比例增长,通过检测PCR过程中的荧光变化即可得知产物数量的信息[2]。
为了消除PCR前很多步骤对定量的影响,常采用一些生物体内稳定存在的基因如β-actin(β肌动蛋白)GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)等作内参照。
根据各自检测结果得出待测基因的相对浓度(待测基因浓度/参照物浓度)[3,4]。
用此法检测IgH重排的难度在于其重排是多种多样的,不可能用单一的引物和探针进行扩增。
一般实验过程为:
用IgH基因中的保守序列设计共有引物(consensusprimers)扩增出标本中的肿瘤克隆,对其测序,根据测序结果为每个病例设计一条克隆特异性的TaqMan探针,再配合一端或两端的ASO(Allele’specificoligonucleotides)引物进行RQ-PCR[5]。
从而排除其他B细胞克隆的干扰,对肿瘤克隆进行准确定量。
RQ-PCR就像一把非常有用的尺子,而尺子的刻度必须由标准品来确定,所以标准品的状况越接近样品越理想。
理想的实验是将每个患者的肿瘤克隆扩增产物克隆到质粒中,用含有目的基因的质粒倍比稀释后作为标准品[4]。
在ALL(急性淋巴细胞白血病)MRD的研究中,也有人采用初诊时的骨髓作标准品。
因为此时骨髓中的肿瘤细胞通常都占很大比例[3]。
TaqMan荧光探针实时定量PCR较既往定量方法在PCR扩增过程中加入了探针杂交提高了PCR的特异性实时检测动态反应扩增产物的生成效率,能更准确地对原始模板进行定量。
闭管操作,最大限度避免了污染,无PCR后处理,可重复性好[6,7]。
由于这些优点,使其在定量检测IgH重排中得到广泛应用。
目前,以IgH重排为靶基因,采用RQ-PCR定量检测MRD的研究主要集中在B淋巴细胞肿瘤中。
Donovan等[4]对儿童ALL的IgH重排进行了扩增并测序,比较测序结果后设计针对FR3区域的7条探针。
用其配合克隆特异性引物(ASO引物)追踪了童ALL中IgH重排数量的变化,MM是骨髓中病变浆细胞克隆性增生的结果。
造血干细胞移植(HSCT)为其获得更好的治疗效果提供了一个可行的途径[8]。
为了更准确地评价治疗效果。
研究者开展了定量检测肿瘤细胞的工作。
比利时(荷兰的一个血液肿瘤研究组[9]在5个实验中心分别采用极限倍比稀释法及RQ-PCR法通过检测IgH重排数量,对MM骨髓中的肿瘤细胞进行定量。
结果显示RQ-PCR精确性高,用此法定量检测系列稀释倍数的标本,曲线的相关系数都在0.99以上,而同样的标本倍比稀释法的相关系数只在0.91~0.93间。
当RQ-PCR的敏感性达1.25×
10-5时,后者为1.25×
10-4。
可重复性亦优于传统倍比稀释法,RQ-PCR不同实验结果之间的变异系数只在0.21,而后者却高达0.77。
这些显示了RQ-PCR方法在定量检测上的优越性。
已有不少研究[10]显示,大剂量化疗后用G.CSF动员收集到的造血干细胞(HSC)中存有残留的肿瘤细胞。
Marco等用RQ-PCR通过检测IgH重排的拷贝数来衡量收集到的HSC中肿瘤细胞的水平。
他们分别采集了治疗开始的+60天和+100天用5g/m2CTX化疗+G-CSF动员的骨髓和外周血(PB)的HSC。
发现重复的大剂量化疗对减少HST中肿瘤负荷并无太大帮助,因为第2次IgH重排拷贝数较第1次并无太大变化(P=0.84)。
一同收集的骨髓和外周血HSC中,所含肿瘤细胞的水平骨髓标本是明显高出外周血。
它们间差异的中位数=2.68logs。
并且外周血HSC中肿瘤负荷与骨髓中的并不相关,往往BM中非常高而PB中却很少。
基于这些实验数据,他们建议应将外周血造血干细胞(PBSCT)作为自体移植的首选干细胞来源。
他们还将用RQ1PCR法测得的残留肿瘤细胞水平与以CD38为标记的流式细胞仪检测结果作了比较。
发现PB中后者所得的MRD水平远较RQ-PCR法高,分析可能由于动员末期采集
的PB标本中,有许多CD+38的细胞并不是恶性克隆。
所以,用RQ-PCR法分析MRD将更精确,更特异[11]。
2PCR检测双重重排(dualrearrangement)在淋巴细胞恶性淋巴瘤中应用
近10年来,淋巴系统恶性肿瘤的双重重排(同时存在Ig与TCR基因的单克隆重排)现象时有报道。
Vergier等[12]报道过在前B细胞原始淋巴细胞白血病中,60%的病例可以检测到双重重排,而在恶性淋巴瘤中的检测率较低,13%的B细胞和T细胞淋巴瘤可观察到。
根据淋巴瘤类型的不同,双重重排的检测率也存在差别。
在B2NHL中,套细胞淋巴瘤(32%)及淋巴母细胞淋巴瘤(21%),T2NHL中,血管免疫母T细胞淋巴瘤(AILT,46%)及SezarySyndrome(SS,55%)中双重重排的发生率较高。
通过本课题组研究,我们[13]认为,发生双重重排的B2NHL主要分布在黏膜相关型边缘区B细胞淋巴瘤,T2NHL主要分布在外周T细胞淋巴瘤及肠病型T细胞淋巴瘤。
研究淋巴瘤中双重重排的病理意义的小组观察到不同的结果。
Theriault等[14]发现在检测到双重重排的B2NHL病例中,肿瘤性B细胞中有大量的非肿瘤性T细胞的浸润,推测发生TCR2γ基因的克隆性重排可能只是浸润的T淋巴细胞的寡克隆扩增而并非真正的双重重排。
但是Vergier等[12]对2例B2NHL(1例为弥漫性大B细胞淋巴瘤,另1例为套细胞淋巴瘤),2例T2NHL(1例为AILT,1例为SS)行微切割进行IgH和TCR2γ的PCR检测,发现有2例(1例为SS,1例为套细胞淋巴瘤)在同一肿瘤细胞上同时发生了IgH及TCR2γ基因的重排,而另外2例仅检测到与其免疫表型相一致的单克隆重排。
AlSaati等[15]也报道过这种特殊的具有B/T双基因型的淋巴瘤细胞系,并将其命名为Deglis细胞。
双重重排发生的机制目前也不十分清楚,推测有以下几种可能:
(1)T和B肿瘤细胞各自同时重排,即双起源性双克隆重排;
(2)同一肿瘤细胞上发生的双重重排。
Hollingsworth等[16]报道了3例双重重排的病例,其中2例是AIDS患者,另1例为肾移植患者,同时他还检测到有2例存在EBV的感染,这些结果表明检测到双重重排的患者可能存在着免疫缺陷或是免疫紊乱。
但是在检测到双重重排的患者中更多的并不存在以上明显的免疫缺陷。
推测原因可能是IgH和TCR基因同属免疫球蛋白基因超家族的成员,两者序列相似,在淋巴细胞分化过程中会出现错误的双重重排;
或是当TCR基因重排后,其表达产物可以作为抑制IgH基因重排的信号,阻碍IgH的重排,在肿瘤情况下抑制机制失调从而出现双重重排[17]。
由于存在双重重排的现象,因而用
PCR来检测样本DNA中IgH和TCR的克隆性重排并不能作为判断肿瘤来源的金标记,当检测结果为双重重排时,目前可以采用的对策是联合轻链(IgL)的重排检测或用southern印迹法来辅助诊断。
研究者关心更多的是双重重排的意义。
Garcia等[17]认为双重重排的B2NHL的增殖指数更高一些,但是这种趋势并无统计学意义,在T2NHL中,双重重排的增殖指数低。
本研究组[13]的初步研究结果提示,在NHL中增殖指数与淋巴瘤基因双重重排无相关性。
虽然双重重排的发生与高增殖指数、特殊的形态和免疫学表型看上去无关,但最终的结论必须采用大样本,病理类型构成符合疾病的发病率及长期的随访并深入到肿瘤细胞水平上来进行。
3PCR-SSCP分析技术及在肿瘤中应用
PCR产物的单链构象多态性分析(PCR-SSCP)是在PCR的基础上,根据被扩增的单链DNA片段在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时,含有点突变基因会发生迁移率的改变,从而与其正常基因片段区别开来这一事实,由NoumiT等人首次建立的[18],1989年后SSCP技术得到不断的完善和发展。
至今,该项技术已成为一种快速、敏感、筛查已知突变位点,识别未知突变,并广泛应用于多态性的分析。
SSCP分析技术的基本程序为:
首先PCR扩增特定的靶序列,然后将扩增长度变性为单链,行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外,更主要的是取决于DNA单链所形成的构象[19]。
在非变性条件下,DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象,这种构象由DNA单链碱基决定,其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用(主要为氢键)来维持。
相同长度的DNA单链其顺序不同,甚至单个碱基不同,所形成的构象不同,电泳迁移率也不同,PCR产物变性后,单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳,因靶DNA中发生单碱基置换,或个别碱基插入或缺失时,因迁移产生变化会出现泳动变位,从而可将变异DNA与正常DNA区分开[20]。
由此可见,PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术,它根据形成同一构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。
SSCP方法最初采用放射性同位素32P标记[19],该方法具有污染大,程序复杂的缺点。
随后,非同位素标记的SSCP法应运而生,银染技术是按常规PCR扩增特定靶基因序列,扩增产物变性为单链进行非变性聚丙酰胺凝胶电泳,再通过硝酸银(AgNO3)染色显示结果。
银染法具有需要样品量少,操作简单,费时少,其检测的敏
感性与同位素法相近,且没有同位素污染可用于常规诊断,有广阔的应用前景,结果可以永久保存,是十分方便和敏感方法。
目前,国内外经常采用荧光检测技术用于PCR-SSCP分析,提高了检测灵敏度,特异性好[21]。
最近几年,利用毛细管电泳对PCR产物作SSCP分析,筛查突变,国内外已开始了探索,毛细管电泳技术具有快速、高效、样品消耗少等特点,已经在寡核苷酸的分析方面显示独特优越性[22],因此,非同位素标记的分析SSCP法是一种简单、安全、快速,有效的分析点突变的方法。
SSCP分析结果的检出率主要受温度,甘油,片段长度等条件的影响[23]。
首先用于SSCP分析的核酸片段越小,检测的敏感性越高[24],有资料表明用<
200bp的片段进行SSCP时,可发现其中70%的变异,对于300bp左右的片段则只能发现其中50%的变异,而>
500bp的片段,则仅能检出10%,30%的变异,因此,<
300bp,尤其是150bp左右的核酸片段能检出100%的变异,所以,>
400bp的产物需把其处理成<
400bp的DNA片段,再进行SSCP分析。
LiuandSommer[25]利用限制性内切酶酶解大片段解决了这一问题,从而延长了SSCPDNA片段的检测长度,大大提高了突变基因的检出率。
其次,凝胶中加入低浓度的变性剂,如5%,10%甘油,5%尿素或甲酰胺,10%二甲亚(DMSO)或蔗糖等有助于提高敏感性[26],可能是因为轻微改ssDNA的构象,增加分子表面积,降低了ssDNA的泳动率。
但有些变异序列却只能在没有甘油的凝胶中被检出[26]。
一般认为保持凝胶内温度恒定SSCP分析最关键的因素[27],温度有可能直接影响DNA分子内部稳定力的形成及其所决定的单链构象,从而影响突变的检出。
室温电泳适于大多数情况,但由于在电泳时,温度会升高,为确保电泳温度相对恒定,应减少凝胶厚度,降低电压,有效的空气冷却或循环水冷却等。
Ravnik-Glaval等人提出10%胶[28],113%胶粘度等为最适条件,作者还认为碱基的组成决定最适胶成分,提出较高比例的G+C碱基组合应由蔗糖作为低浓度变性剂掺入胶中而不是甘油。
Leren等人利用4种不同条件得到100%突变检出率的理想结果[29],提出对同序列只用单一的条件,检出率为77%,87%,要得到100%的检出率,可能必需采用多种条件,例如在进行未知突变种类的SSCP分析时,最好采用两种以上凝胶浓度,可以提高突变种类的检出率。
Sheffied[9]研究指出,包括突变的片段和突变所在的位置影响检出率,对同一片段的研究时需用不同的引物,使用限制性内切酶产生不同的片段提高检出率。
1992年Sarkon等人[30]的研究结果发现了
RNASSCP的检出率明显高于DNASSCP,提出RNA较DNA更有可变性,可能
因为DNA较短的发夹结构以及其2’-羟基上有很强的结合力,使DNA的次级结
构较RNA稳固,因此,若DNA发生突变,不易产生迁移率的改变。
SSCP的不足之
处主要是可能检出假阴性结果。
首先,SSCP分析技术是通过对基因的外显子和
cDNA分析研究筛查致病基因,从而探索某些疾病的发病机理的常用手段。
而对于
一些致癌基因的研究,SSCP技术也显示了其独特的优越性[30],例如作为研究
p53抑癌基因,以及定位于9号染色体上的p14,p15,p16瘤相关基因的常用工具
[31,32],
PCR技术在肿瘤研究中的应用包括在基因过表达的检测,表达产物的检测基
因扩增的检测,基因突变的检测,微卫星不稳定性分析,端粒酶及其检测。
分
子生物技术是肿瘤分子病理研究具有划时代意义的检测手段,拓宽了病理学研究
的范围,使我们对肿瘤发生发展、形态特征、生物学行为的认识进入分子水平,PCR
技术广泛用于肿瘤病理研究领域。
PCR技术本身已比较成熟,一般都具有敏感
性高的特点但影响因素较多,最大的问题为技术性假阳性和假阴性。
PCR技术,
要使检测技术具有高敏感性,又要确保检测结果的高特异性和重复性,质量控制至
关重要,关键在于建立标准化的实验操作程序这样才能对肿瘤研究提供有意义的
指标。
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