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遗传学、畜牧兽医学等研究领域有无限广阔的前景。
目前转基因技术大多采用受
精卵细胞的显微基因注射技术或电转移技术,其操作包括外源基因重组载体的构
建、受精卵细胞的采集、外源基因的显微注射、注射后受精卵(或胚胎)的移植、
转基因小鼠的检测等步骤。
国外已建立了人遗传病和癌基因的转基因动物模型,
用于肿瘤和遗传学研究,但这方面的研究在我国尚属起步阶段。
转基因动物模型研究中广泛采用的SV40(SimianVirus40,SV40)属乳多郑州大学2008年博_l:
学位论文SV40T抗原基因在转基因小鼠胃壁细胞特异性表达及生物学特性研究
空病毒科(papovaviridae)多瘤病毒属(polyomavirus),在病毒DNA复制前编码
2种转化蛋白,即大T抗原(largeTantigen,Tag)和小T抗原(smalltantigen,
tag)oTag是一种磷酸化蛋白,在细胞转化中起决定性作用,为细胞转化所必需。
tag是非磷酸化蛋白,对细胞转化并非必需,但可起加强作用。
SV40基因编码的
大T抗原己广泛应用于转基因动物肿瘤模型的建立。
如Santarelli等将SV40T
基因导入小鼠细胞构建了小鼠乳腺癌动物模型;
Brister等将SV40T基因和含金
属筑基基因的融合基因质粒导入小鼠生殖系产生的转基因小鼠成年后可发生脑
脉络从乳头状瘤,Hochman建立了眼部肿瘤转基因小鼠模型。
胃壁细胞是胃底腺的主要细胞类型之一,能合成和分泌盐酸,从而刺激胃肠
道内分泌细胞和胰液的分泌。
H丫K'
ATP酶(H丫K"
ATPase)基因在胃壁细胞中特异
性表达,和胃酸的合成与分泌有着直接关系。
Gordon建立了在胃壁细胞中特异
性表达人生长激素(humangrowthhormone,hGH)、内在因子(intrinsicfactor,
INF)的转基因动物模型,为研究胃薪膜上皮细胞的发生、演化过程奠定了基础。
我们构建胃壁细胞H丫K'
ATPase亚基启动子驱动下的SV40T基因的真核表达
载体,并将其导入小鼠受精卵细胞建立转基因动物模型。
该模型动物将实现
SV40T基因在胃壁细胞中的特异性表达,并诱发小鼠胃壁细胞增生,胃薪膜发生
癌前病变、癌变等一系列病理性改变,从而为胃癌发生机理的研究、胃癌的诊断
与治疗、胃癌特异性药物的筛选提供十分有用的实验动物模型。
方法
一、SV40T基因胃壁细胞特异性表达载体的构建
1.扩增H'
/K'
ATPase亚基启动子:
采用酚一氯仿法从小鼠肝细胞中提取基因
组DNA,PCR扩增H'
ATPase亚基启动子,PCR产物命名为HK.
2.pMT/HK的制备:
将PCR产物纯化回收后与pMT18一载体相连,转化感受态E.
coliDN5Q细胞,从转化平板上随机挑取8个单菌落,37℃摇菌过夜培养,
取菌液提取质粒DNA,XbaI,BamHI双酶切鉴定出阳性克隆,命名为pMT/HK
并进行测序鉴定。
3.构建pcDNA3.1/HK质粒:
将pMT/HK用XbaI,BamHI双酶切,琼脂糖凝胶电
泳,切胶回收约1060bp的DNA片段。
将回收产物与用XbaI,BamHI双酶切的
pcDNA3.1
(一)质粒连接,转化感受态DH5a细胞,从转化平板上挑单菌落,
郑州大学2008年博士学位论文SV40T抗原基因在转基因小鼠胃壁细胞特异性表达及生物学特性研究
提取质粒DNA,限制性内切酶消化鉴定出阳性重组克隆,记作pcDNA3.1/HKo
切,琼脂糖凝胶电泳,切胶回收约2700bp的DNA片段,将回收产物与用BamffI
酶切的pcDNA3.1/HK连接,转化感受态细胞DH5a,从转化平板上挑取单菌落,
37℃摇菌过夜培养,取菌液提取质粒DNA,酶切鉴定重组体,并测序鉴定SV40T
基因插入的方向及DNA序列,插入方向正确的重组体记为pcDNA3.1/HKSVo
5.构建pcDNA3.1/SV质粒:
将pLITAg质粒用BamHI酶切,琼脂糖凝胶电泳,切
胶回收约2700bp的DNA片段,将回收产物与用BamHI酶切的pcDNA3.1
(一)连
接,提取质粒DNA,酶切鉴定重组体,经测序鉴定插入方向正确的重组体记
为pcDNA3.1/SVo
二、特异性表达SV40T基因转基因小鼠的建立
1.制备转基因用DNA:
提纯pcDNA3.1/HKSV质粒DNA,用限制性内切酶XbaI,
l(pnI双酶切。
反应产物用0.7%琼脂糖凝胶电泳,凝胶回收试剂盒回收3.7kb
H'
/K+ATPase亚基启动子//SV40T基因片断,用于显微基因注射。
2.准备结扎雄鼠、供体雌鼠、假孕雌鼠等实验动物,采集受精卵,进行受精卵
雄原核的显微基因注射,将注射后形态良好的胚胎移植到假孕雌鼠输卵管中。
三、特异性表达SV40T基因转基因小鼠的鉴定与繁殖
1.PCR检测转基因阳性首建鼠与Fl代仔鼠:
剪取出生仔鼠尾尖,提取基因组DNA,
PCR扩增鉴定转基因阳性首建鼠与F1代仔鼠。
2.Southernblot检测F1代转基因阳性鼠:
取PCR检测阳性F1代鼠的肝组织,提
取基因组DNA,Southernblot鉴定转基因阳性F1代仔鼠。
3.RT-PCR检测SV40TmRNA的表达:
Trizol试剂盒提取68"
首建鼠、未转基因B6阴
性鼠胃及转基因阳性鼠胃、食管、十二指肠、盲肠、空肠、肝脏、心脏、肺、
肾、脾、骨骼肌等组织的RNA,进行逆转录PCR,检测SV40TmRNA的表达。
4.免疫组化检测SV40T蛋白表达:
取F1代阳性鼠与未转基因B6阴性鼠胃、食管、
十二指肠、盲肠、小肠、肝脏、心脏、肺、肾、脾等组织进行石蜡包埋与常
规切片,免疫组化检测SV40T抗原表达。
四、特异性表达SV40T基因转基因小鼠的生物学特性
1.HE染色观察转基因鼠胃粘膜形态学改变:
取F1代阳性鼠与未转基因B6阴性鼠
郑州人学2008年博士学位论文
胃组织进行常规切片,HE染色后观察转基因鼠胃粘膜厚度与形态学改变。
2.透射电镜观测胃粘膜细胞亚显微结构的变化:
取未转基因B6鼠与转基因阳性
鼠的胃组织,固定、脱水、包埋、聚合、切片、染色后透射电镜观测胃粘膜
壁细胞亚显微结构的变化。
3.小鼠胃液酸度值的测定:
取未转基因B6鼠与阳性转基因鼠各8只,禁食24h后,
采用幽门结扎法收集胃内容物,离心分离胃液上清液,检测胃液PH值。
4.TUNEL实验检测细胞凋亡:
取未转基因B6鼠与转基因阳性鼠的胃组织,常规
操作制备石蜡切片,按TUNEL原位杂交试剂盒推荐方法进行细胞凋亡检测。
5.统计学分析:
应用SPSS12.0统计学软件进行统计处理,计量数据均用均数士
标准差(z士:
)表示,两组均数的比较采用t检验,多样本均数的比较采用
方差分析,检验水准a二0.05.
结果
1.pMT/HK质粒的构建:
小鼠肝组织基因组DNA用引物PI,P:
扩增得到
H"
ATPase亚基启动子,扩增产物经lOg/L琼脂糖凝胶电泳可见约
1060bp的DNA条带,与预期长度吻合。
构建的pMT/HK质粒用XbaI、BamHI
双酶切电泳,可见到约1.06kb与2.6kb的两条DNA条带,与预期结果一致。
2.H'
ATPase亚基启动子DNA测序:
pMT/HK测序显示,PCR扩增的
ATPase亚基启动子长度为1057bp。
测序结果与lorenz发表序列经
NCBI网站的Blast2sequences对比分析,发现一501bp与一634bp之间均存
在碱基重复序列,并且不同小鼠扩增产物测序以及与文献序列之间比对发现
存在1到2个重复序列的不同,推测此段序列可能为多态性位点。
3.pcDNA3.1/HKSV质粒的鉴定:
pcDNA3.1/HKSV用XbaI,BamHI双酶切电泳,
可见到约Ikb,2.7kb与5.4kb的三条DNA条带;
用XbaI,h加I双酶切电
泳,可见到约3.7kb与5.4kb的两条DNA条带;
用BamHI单酶切电泳,可见
到2.7kb与6.4kb的两条DNA条带;
用EcoRI单酶切,只见到约9.lkb的
一条DNA条带,酶切电泳结果均与设计一致。
4.pcDNA3.1/SV表达载体的鉴定:
pcDNA3.1/HKSV用BamHI单酶切电泳,可见
到约2.7kb与6.4kb两条DNA条带;
pcDNA3.1/SV用BamflI单酶切电泳,可
见到约2.7kb与5.4kb两条DNA条带;
pcDNA3.1用BamHI单酶切电泳,仅
见到一条5.4kb的DNA条带,酶切电泳结果均与设计一致。
5.SV40T基因测序结果:
经DNA测序分析验证了pcDNA3.1/SV2是SV40T基因以
正确方向插入而构建的重组质粒,且pcDNA3.1/HKSV质粒中SV40T基因测序
结果与NCBI公布的NC-001669序列完全一致。
1.显微注射DNA的回收纯化:
Xbal,Rpnl双酶切表达载体pcDNA3.1/HKSV,
回收约3.7kb的DNA片段,溶于显微注射用TE缓冲液,将其终浓度稀释至
3ng/glo
2.转基因小鼠的制备:
共对150只小鼠进行超排卵,有96只小鼠合笼后产生
阴栓,得到受精卵2500余枚,平均超排卵26枚/只(2500/96)。
选取发育
正常、原核清晰的受精卵548枚用于显微注射,短暂培养后取422
枚健康完好受精卵移植16只受体鼠,生患77只,移植成功率为18.2960
1.转基因小鼠的PCR检测:
PCR检测77只G。
代小鼠,共有10只小鼠扩增出特
异性条带,分别为20,4"
8"
16`,24"
51"
57"
61"
68"
73"
,且阳性
对照条带明显,阴性对照无条带。
转基因鼠的阳性率约为13.0%(10/77)o
2.首建鼠的繁殖与Fl,F2代仔鼠的PCR检测:
将首建雌鼠与B6雄鼠1:
1、首
建雄鼠与B6雌鼠1:
2合笼。
发现除68"
不育外,其他9个品系共生出99只
仔鼠。
8‘品系所生的23只仔鼠PCR检测均为阴性,2"
4"
16"
24"
57"
73,所生的76只仔鼠检测到31只阳性鼠,阳性鼠比例为40.8%
(31/76)。
将F1代阳性鼠与B6鼠合笼,4"
73‘品系
共生出51只F2代仔鼠,PCR检测到27只阳性鼠,阳性鼠比例为52.9%
(27/51),F1,F2代雌雄鼠比例基本为l:
to
3.转基因小鼠的Southernblot检测:
将44,16"
1^-2只PCR
检测阳性Fl代转基因小鼠处死,取其肝脏提取基因组DNA,BamHI过夜消化
电泳检测。
地高辛随机引物标记与检测试剂盒I标记SV40T基因PCR618bp
扩增产物为基因探针,与4"
PCR阳性小鼠的基因组DNA
进行杂交,5个品系小鼠在2.7kb和3.8kb处均出现明显的杂交带,而未转
基因B6鼠无。
4.转基因小鼠的RT-PCR检测:
分离处死的68坏育鼠、F1代阳性鼠与未转基因
鼠的胃、食管、肝、脾、肾、心脏、胰腺、肺、十二指肠、盲肠、空肠、骨
骼肌、翠丸或卵巢等组织,提取总RNA进行RT-PCR与电泳分析。
各组织均
扩增出443bp的内参GAPDH条带,68.不育鼠与Fl代阳性鼠的胃组织扩增出
272bp的SV40TmRNA转录条带,而68”不育鼠与Fl代阳性鼠的食管、肝、脾、
肾、心脏、胰腺、肺、十二指肠、盲肠、空肠、骨骼肌、翠丸或卵巢及未转
基因鼠胃组织均未扩增出SV40T特异性基因条带。
5.转基因小鼠的免疫组化检测:
Fl代阳性鼠与未转基因B6鼠胃、食管、十二
指肠、盲肠、小肠、肝脏、心脏、肺、肾、脾、脑等组织免疫组化显示,SV40T
抗原仅在F1代转基因阳性鼠的胃组织中表达,而在转基因阳性鼠食管、十
二指肠、盲肠、空肠、肝脏、心脏、肺、肾、脾、脑及未转基因B6鼠胃组
织均不表达。
1.转基因鼠胃组织形态学观察:
转基因鼠的胃粘膜明显增厚,胃小凹与胃底腺
拉长,胃底腺中成熟壁细胞数目减少,未成熟前体细胞数目显著增加。
2.转基因鼠胃粘膜厚度的改变:
出生后35d,60d,120d转基因阳性鼠相对于同
龄未转基因鼠胃粘膜厚度明显增加,分别为393士59gm,495士68H,m,715士
79pm与243士47gm,300士62pm,315士56gmo
3.电镜观测胃粘膜壁细胞亚显微结构的变化:
转基因鼠的壁细胞相比于未转基
因对照鼠体积缩小,线粒体数目减少,胞内微管泡系统不发达甚至缺如。
4.小鼠胃液酸度测定:
对未转基因阴性鼠与转基因阳性鼠的胃液酸度进行测定,
(P<
0.01)。
5.TUNEL实验检测细胞凋亡:
正常B6对照鼠凋亡细胞多仅见于胃粘膜上皮的表
面粘液细胞,而转基因鼠除表面粘液细胞发生凋亡外,在胃底腺处尚存在部
分凋亡细胞。
未转基因对照鼠与转基因阳性鼠胃粘膜总的细胞凋亡率分别为
2%与1596,而在胃底腺处,未转基因对照鼠与转基因阳性鼠的细胞凋亡率分
别为0.5%与1296,二者相比具有显著性差异(P<
0.01).
6.转基因鼠胃粘膜组织病理学改变:
转基因阳性鼠均表现为腺上皮增生,有些
品系转基因鼠尚出现萎缩性胃炎,局部囊性扩张,腺体数量减少,坏死和炎
性渗出等病理学改变。
7.不育首建鼠的检测:
68‘雌鼠出生后发育明显落后于同龄其它首建鼠,并且不
育。
被毛稍稀疏,行动迟缓,腹部膨大。
出生后150d将其处死解剖,发现胃
体出现覃伞形肿瘤,腹腔中尚存在直径约8mm的腹膜瘤。
而该鼠食管、肝、
脾、肾、心脏、胰腺、肺、十二指肠等组织未见明显病变。
结论
1.构建了胃壁细胞H丫K'
ATPase亚基启动子驱动下表达SV40T抗原基因的真
核表达载体,完成了对H丫K'
ATPase亚基启动子的测序分析,发现存在的
重复序列多态性位点。
2.建立了胃壁细胞中特异性表达SV40T基因的转基因小鼠,RT-PCR与免疫组化
证实该基因在转基因鼠的胃粘膜特异表达,转基因鼠呈现胃粘膜增厚,胃底
腺拉长,成熟壁细胞数目明显减少等形态学改变。
3.转基因鼠壁细胞微管泡系统不发达,线粒体数目减少,胃酸分泌显著降低,
细胞凋亡率增加。
转基因鼠可发生萎缩性胃炎、局部囊性扩张等病理学改变。
4.不育转基因首建鼠存在荤伞状胃部肿瘤和腹腔肿瘤,为转基因胃癌动物模型
的建系与胃癌发病机理的研究提供了十分有用的实验动物模型。
关键词SV40T抗原;
真核表达;
Southern印迹;
转基因小鼠;
定位表达.
引言·
.........................................................................................1
第一部分SV40T基因胃壁细胞特异性表达载体的构建
材料与方法·
.................
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