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另外,市场管理的混乱导致市售灵芝药材中常常以次充好,鱼目混珠,严重影响了灵芝的药效和中医药临床疗效及其安全性。
因此,我们急需制定切实可行的灵芝药材质量标准,涵盖栽培、形态、生理生化和分子生物学等多方面,并对灵芝属菌株进行全面系统的研究,继而建立一个全国性的数据库系统,为灵芝属的分类学、生物活性研究和灵芝产品幵发提供有效的理论依据。
该文重点介绍基于近红外光谱检测技术检测灵芝几种主要活性成分及其生物活性的国内外研究现状,旨在进一步推动灵芝产业的快速发展,并为保健食品、药品的研究和生产提供科学依据。
2.近红外分析技术及研究进展
2.1近红外检测技术
近红外光是波长范围分布在780~2526nm,换算成波数范围在3959~12820cm-1的一种电磁波按照波长范围可划分为短波近红外(SW-NIR),其波长范围在780~1100nm和长波近红外(LW-NIR),其波长范围在1100~2526nm[4]。
在短波近红外波长范围内,近红外光谱检测方式主要采用透射方式,直接穿透所测样品,取得样品深层信息的近红外吸收光谱,常用于溶液与固体样品的检测;
而在长波近红外波长范围内,近红外光谱检测方式主要采用入射光与反射光的光强关系来获得物质在近红外区的吸收光谱,常用于固体和半固体类样品的测量。
近红外光谱所反映的主要信息来自于分子中原子间含氢基团(主要包括O-H、C-H、N-H、P-H等)的振动合频与各级倍频的吸收特性,信息涵盖极为丰富[5]。
这些基团是有机物中结构和组成最重要的一些基团,在NIR谱区几乎可以找到所有有机物与之对应的特征吸收信号,且容易获取稳定的谱图。
正是通过这些丰富的结构与组成信息NIR分析技术才可以分析测定与这些基团有关的成分以及物理、化学性质,如物质的密度、黏度、颗粒的大小以及有关样品的电学、热学和力学性质等。
近红外光谱不仅能够反映绝大多数有机化合物的组成和结构信息,而且对某些无近红外光谱吸收的物质(如某些无机离子化合物),也能够通过对其共存的本体物质的影响而产生的光谱变化,间接地反映它们存在的信息。
近红外光谱分析技术包括定性分析和定量分析,定性分析的目的是确定物质的组成与结构,而定量分析则是为了确定物质中某些组分的含量或物质的属性。
与常规的化学分析方法不同,近红外光谱分析法是一种间接分析技术,是用统计学的方法在样品待测属性与近红外光谱数据之间建立一个校正模型。
因此在对未知样品进行分析之前需要搜集一批用于建立校正模型的校正样品,获得近红外用近红外光谱仪器测得的样品光谱数据和用化学分析方法测得的真实数据。
通常采集的近红外光谱会包含一些与待测样品性质无关的因素带来的干扰,导致基线漂移、随机噪音及光谱的不重复[6]。
合理的对光谱进行预处理可以提取有效的近红外光谱信息,消除各种非目标因素对光谱的影响,奠定模型建立和未知样品组成或性质预测的基础。
因此对原始光谱进行预处理是非常必要的。
常见的光谱预处理方法主要包括中心化、平滑、求导、多元散射校正、归一化等。
其中中心化使得所有数据都分布在零点两侧,可充分反映信息的变化。
平滑是常用的一种消除小方差,保留大方差的方法。
求导可消除基线偏移,克服谱带重叠。
多元散射校正(MSC)可以消除漫反射光谱中样品的镜面反射及不均匀性造成的噪音,消除漫反射光谱的基线及光谱的不重复性。
归一化可以消除光谱的变化或样品稀释浓度等变化对光谱产生的影响。
采用不同预处理方法建立近红外光谱预测模型时,R2越大,RMSEC越小,模型的预测效果越好。
近红外光谱分析技术具有对环境无污染、不破坏样品、成本低、无需前处理等许多优点,在提高灵芝品质检测分析水平、控制灵芝制品质量与成本、减少资源损失等方面具有巨大的优势和无可比拟的发展前途。
2.2灵芝多糖的检测
灵芝多糖是由肽多糖、葡萄糖、杂多糖等多糖均一体组成的混合物,含有少量D-阿拉伯糖、D-木糖、D-半乳糖、D-甘露糖、L-岩藻糖、L-鼠李糖和L-阿拉伯糖等单糖。
目前已分离到的灵芝多糖有200多种,是灵芝的最有效成分之一,其中大部分为β-型的葡聚糖,少数为α-型的葡聚糖。
灵芝多糖以一种蛋白多糖的形式存在,其中多糖的含量为30%~60%,由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和岩藻糖等组成,其中蛋白含量为20%~30%。
灵芝多糖蛋白中的糖链与肽链上丝氨酸或苏氨酸通过α-糖苷键连接。
多糖和多糖蛋白的分子量为2.0×
103~5.8×
105Da,其单糖主要由口葡萄糖为主的杂多糖构成。
单糖之间主链以β-(1→3)、β(1→4)糖苷键连接,支链以β(1→6)糖苷键连接[7]。
NIR主要用于确定糖苷键构型及常规官能团。
在500~4000cm-1对多糖进行红外光谱扫描,α-糖苷键常在840cm-1出现峰,β-糖苷键常在890cm-1出现峰;
在1010~1100cm-1若有3个强吸收峰则可判定为吡喃糖苷,若有2个峰则为呋喃糖苷;
810、870cm-1是甘露糖的吸收峰,1260与1730cm-1是酯基或O-乙酰基的特征吸收峰;
3440cm-1处为-OH的吸收峰;
2935cm-1处为C-H伸缩振动的吸收峰[8]。
余钰骢[9]选择浙江赤灵芝子实体热水浸提后的灵芝渣为原料,采用高温高压强酸水解提取灵芝结构多糖,对灵芝结构多糖水解物进行了分离纯化,将分离出的产物单体进行近红外定性分析,通过近红外光谱检测器对GLP1和GLP2这两种组分的结构进行分析,发现这两种组分都具有多糖典型的吸收峰,并且初步断定为B型多糖,HPLC纯度检验表明,GLP1和GLP2均为均一的多糖组分,通过HPLC出峰时间计算出GLP1的Mn为1489D,GLP2的Mn为4913D。
Peng等[10]也用SepharoseCL-6B柱层析从松杉灵芝菌丝体的胞外粗多糖中提取了2种杂多糖,分别为EPF1和EPF2,通过近红外色谱(NIR)、气相色谱、核磁等方法对它们的结构组成进行了研究:
2种杂多糖均含有甘露糖、葡萄糖、木糖、半乳糖和葡萄糖胺。
何晋浙[11]等采用沸水回流法从灵芝子实体中提取多糖,经HIO4氧化、Smith降解及甲基化反应,并利用多糖及刚果红混合液在碱性溶液中的波长的红移变化,通过UV-VIS,IR,GC,GC-MS,NMR对灵芝水提多糖的结构特征及三螺旋体结构进行分析研究。
结果表明:
灵芝多糖含有三螺旋体构型,GC-MS分析灵芝多糖的主要单糖组分为葡萄糖,还有少量的半乳糖、甘露糖、木糖和艾杜糖,IR及1HNMR分析多糖为β-构型,HIO4氧化、Smith降解和甲基化分析表明:
多糖主要为(1→3)糖苷键连接构型,并伴有少量的1→6位支链键连接的结构,灵芝多糖是由D-葡萄糖单元通过β-(1→3)糖苷键连接葡聚多糖,其主要构型特征为(1→3)β-D-线性连接的骨架结构。
Liu等[12]利用NIR分析两种灵芝多糖GLP和H-GLP,发现H-GLP在2970和1379cm-1处出现了新的吸收峰,验证了H-GLP是在GLP上通过结构改造引入了CH3基团。
Xu等[13]将灵芝子实体多糖GLP羧基衍生化得到C-GLP,两种多糖在500~4000cm-1中有相似的红外光谱,但在1601和1421cm-1处的2个强吸收峰证实了C-GLP中羧基的存在。
Guo等[14]用傅立叶变换红外光谱法对灵芝孢子多糖GSG进行分析,样品使用量仅1mg,光谱在890和850cm-1处有吸收峰,分别是β和α构型的特征吸收峰,此外,1078和1039cm-1处的吸收峰证明了GSG为吡喃糖。
郑静[15]等从赤灵芝子实体原粉中分离提纯得到2种均一多糖GLP1-1和GLP2-2,并应用HPLC、SephadexG-100凝胶层析、NIR、UV等方法对分离得到的2种多糖进行纯度鉴别、组分测定及结构分析。
多糖GLP1-1是由木糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、鼠李糖组成,UV光谱和IR光谱显示GLP1-1和GLP2-2均有多糖的特征吸收,并且具有β-吡喃多糖糖基的特征吸收峰;
推断GLP1-1和GLP2-2为β-吡喃杂多糖。
综上所述,结合NIR及1HNMR谱可以有效地对分离纯化的灵芝多糖的结构进行鉴定。
2.3灵芝三萜的检测
三萜类化合物是灵芝的另一类重要化学成分。
灵芝三萜类成分的种类繁多。
截至目前,仅从赤芝中发现的灵芝三萜类成分总数就达135种。
灵芝中的三萜类成分主要分布在子实体的外周,随子实体成熟度的提高而递增,有些三萜类化合物很苦,有些则无苦味,因品种、培养条件和不同生育阶段其含量有所区别,苦味的灵芝其三萜类化合物含量一般较高[16]。
灵芝三萜化合物依据分子中所含的碳原子数不同,可分为C30、C27和C24三大类。
灵芝三萜化合物依据结构、官能团不同,又可以分为灵芝酸、灵芝酸甲酯、灵芝孢子酸、赤芝孢子内酯、赤灵酸、灵赤酸、灵赤酸甲酯、灵芝醇、灵芝醛、赤芝酸、赤芝酸甲酯、赤芝酮、灵芝内酯、赤芝醛等10余种。
灵芝三萜类成分的分子量一般为400~600,化学结构较复杂,为高度氧化的羊毛甾烷衍生物[17]。
Fatmawati[18]等研究表明,C11位的官能团对其药理作用的影响较大,并且C3、C7和C15位所连接的羟基取代基对醛糖还原酶的抑制作用很重要。
灵芝三萜类成分质量控制在近红外光谱中研究较少,一般采用薄层色谱法(TLC),在分析灵芝中三萜类化合物时常用的展开系统有甲苯-乙酸乙酯-乙酸(12:
4:
0.5)、正己烷-乙酸乙酯(1:
1)、正己烷-乙酸乙酯-乙醚(1:
1:
1)、氯仿-乙醚-乙酸乙酯(9:
1)、甲苯-乙酸乙酯-乙酸(13:
0.4)[19],一般常用的显色剂为10%硫酸乙醇,50%硫酸甲醇,加热后,可通过观察斑点颜色的变化初步判断灵芝中四环三萜酸母核上的不饱和性[20]。
Jiang-JiangGao[21]等,用高效液相色谱法(HPLC)以TSKgelODS-80Ts色谱柱(150mm*4.6mm,5um)分析了10个赤芝样品及8个不同产地人工栽培赤芝子实体中6种灵芝醇和13种灵芝酸的含量,结果显示这19种灵芝三萜的含量在10个不同样本中略有差别,但无显著差异,且不同产地的段木栽培对这几种灵芝三萜含量的影响不大。
近红外光谱(NIR)是利用分子吸收红外线引起分子振动能级的跃迁,分子振动有许多基本振动形式,根据振动方向不同、振幅不同、其振动能级各异,可以吸收各种波长的光线形成红外光谱。
Snatzke根据不同骨架的三萜皂苷在1392~1245cm-1特征区的吸收不同来确定其基本骨架[22]。
2.4灵芝蛋白质的检测
灵芝蛋白质是一类重要的活性物质,主要包括真菌免疫调节蛋白、凝集素、糖蛋白和多肽类等,它不仅是灵芝生命活动的重要物质,而且具有的独特免疫原性使其在免疫调节和抗肿瘤等方面具显著效果。
王悦怡,董媛等[23]应用近红外光谱结合偏最小二乘法(PLS)建立测定真菌云芝中蛋白含量定量分析模型。
所建立的模型经过i选择最有效的光谱预处理方法,光谱区域和最适主因子数使模型最优化。
实验结果表明:
采用傅里叶变换在1330nm~1725nm光谱区域,主因子数为6,建立的模型最优。
模型校正集的交互验证均方根误差(RMSECV)为0.010,交互验证所得校正集样品中的蛋白含量的预测值与真实值间相关系数(Rv)为0.968;
应用此模型对预测集样品中的蛋白质含量进行预测,得到预测均方根误差(RMSEP)为0.009,预测集的相关系数(Rp)为0.990。
2.5在线近红外光谱的应用
灵芝是重要的中药材之一,在线质量控制中药生产是一个典型的复杂化工制造工艺过程,生产过程中各种工艺参数的变化直接影响最终产品的质量。
目前,中药生产过程中绝大部分环节缺乏在线检测手段,无法控制有效成分含量,导致中药产品质量的稳定性和均一性较低,产品质量难以保证,极大地阻碍了中药现代化和国际化进程[24,25],也抑制了灵芝检测的进程。
其主要原因之一是缺乏中药制药过程分析方法,诸多过程参数尚无法在线检测,更谈不上实施有效控制。
因此,研究建立灵芝生产过程分析与检测方法是现代中药工程学肩负的艰巨任务。
近红外光谱技术是一种重要的过程分析方法,具有快速、原位、非接触、非破坏性等优点,可同时进行多组分测定,已在石油化工、西药质量监控、农业、化学反应终点跟踪等方面得到广泛应用,但尚未见用于实际生产过程的报道[26],只有相关的模拟实验。
杨南林等[27]选择三七总皂苷为具体分析检测对象,模拟工业现场实况,研究近红外光谱分析技术在中药过程分析中的应用,发展形成适用于分析复杂物质体系中有效组分的快速测定方法。
经实验证明,运用近红外光谱分析技术及分析信息处理技术能对三七总皂苷进行快速、原位分析,因此,可望用于灵芝质量的工业现场在线监控。
2.6近红外在灵芝产地检测中的应用
灵芝产地的不同直接影响着其化学成分、药用价值和临床疗效。
现行药典中使用的鉴别方法未涉及到产地鉴别。
灵芝产地鉴定是保证灵芝的真实性、确切疗效和用药安全的重要环节。
近年来,NIRS技术用于鉴别药材产地的应用越来越多,有学者对蛇床子陋、人参、血竭类中药、黄芪、冬虫夏草、白芷、丹参以及产自中国和韩国的黄芪、灵芝、土茯苓及中国和韩国的当归等的产地鉴定取得满意的结果[28]。
虞科等[29]使用最小二乘支持向量机建立非线性分类模型,对丹参药材道地性进行鉴别,与SVM和BP.ANN相比,该方法具有预测准确率高、运算速度快的特点。
张晓慧等[30]引在主成分分析的基础上利用SIMCA模式识别原理对5个产地连翘分别建立了类模型,基本能正确识别这5个产地连翘。
孙丽英等[31]对不同产地的黄柏药材及其伪品,采用模式识别方法进行聚类分析,建立判别模型并用三重交叉验证的方法对模型稳定性进行验证。
建立模型后对已知训练集样本的分类精度高达100%,对未知样本的预测精度达到100%。
尽管在中药产地鉴定方面的研究取得了一定的进展,但距离实现大规模快速准确鉴定灵芝有一定的差距。
致力于广泛建立灵芝的近红外光谱特征数据库,将对弘扬我国传统医药文化产生深远的影响。
2.7近红外在灵芝掺伪检测中的应用
饶伟文[32]等用药品快速检测车的车载NIRS仪直接测定药材或饮片粉末或药液,形状较均匀的饮片可选择数片代表性的样品,用刀片刮出新鲜的横切面直接用探头扫描,采集NIR光谱,建立了冰片、朱砂粉、蒲黄、青黛等10种及其较常见的伪劣品的近红外鉴别模型,并在药品监督抽样工作中试用。
钟建理等[33]采用二阶导数法和因子化法建立鉴别模型A;
用二阶导数法加矢量归一化和因子化法建立鉴别模型B,用36个样品进行验证,通过A和B的组合能很好鉴别出伪劣的沉香。
NIRS已研究过的药材还有地骨皮和其伪品毛叶探春、防己、黄、蜂蜜[34]。
阳志云等[35]收集不同来源的人工牛黄正伪品,采集其NIRS光谱,进行预处理后,采用矢量归一法加二阶导数法和因子化法建立人工牛黄NIRS鉴别模型能准确鉴别人工牛黄的掺伪品,可用于药品监督抽样的快速鉴别。
林培英等[36]采用近红外漫反射光谱技术,在天然牛黄粉中掺入不等量人工牛黄粉,采集NIRS,运用PLS建立数学模型,用校正样品集进行内部交叉验证及预测样品集进行外部验证,可以快速判定天然牛黄粉中人工牛黄粉的掺入量。
实验结果证明样品“真值”与预测值之间相关性良好。
刘荔荔等[37]用近红外漫反射光谱法可直接测定,通过以建立数学模型,可快速定量识别西洋参中人参掺入量。
胡刚亮等[38]采用近红外漫反射光谱数据,通过PLS进行回归,内部交叉验证,建立校正模型等,可以预测川贝母中浙贝母掺入量。
钟蕾等[39]用NIRS结合聚类分析,能快速、准确地鉴别进口血竭与国产血竭(两者化学成分不同,在原始光谱上就有明显差别),以及国产血竭中的剑叶龙血树和海南小花龙血树来源的树脂。
张治军等[40]用NIRS鉴定冰片中掺伪物樟脑、白矾、芒硝、白糖、白蜡等。
陈小康[41]等釆用红外光谱的宏观三级鉴定法对赤芝、黑芝、松杉灵芝和树舌灵芝进行分析鉴别,为灵芝及其混伪品的鉴别提供了新的有效方法。
3.存在的问题
虽然近红外光谱检测分析技术对灵芝质量的检测分析研究已经持续了多年,但是绝大多数都只是集中于在实验室进行监测分析,只有极少数通过成果转化形成商业化产品,实验研究与市场需求无法很好衔接。
目前,灵芝质量的近红外无损检测还存在以下几点不足。
(1)检测条件(如仪器状态、环境温度、样品状态和检测参数等)不同导致样品光谱数据的不稳定性,因此,如何制定相关样品的检测技术规范,确保光谱数据的稳定性是近红外光谱技术能否用于灵芝质量检测的关键问题[42]。
(2)建模样品的有效选择和样品相似性和异常性判别方法是灵芝质量近红外光谱检测要解决的又一关键问题。
建模样品选择的好坏直接决定了建立的数学模型可靠性的好坏,同时也影响了后期开发的灵芝质量分析检测评价系统的稳定性、准确性和普适性的好坏。
(3)灵芝成分复杂、光谱谱峰重叠严重、数据量大且提取困难、光谱吸收值之间的线性特性高度重合,导致光谱信息提取困难,因此如何确定样品的温度、采集部位以及装样条件有效地实现光谱信息的提取是这些灵芝近红外光谱检测要解决的第3个关键问题。
(4)对于灵芝质量的在线检测,确保准确采集到灵芝有效且稳定的光谱信息以及改善灵芝内部品质近红外光谱响应特性机理和不同建模算法的适用性,提高数学模型的稳健性、具体性和可描述性是灵芝质量近红外光检测要解决的第4个关键问题。
(5)当前,近红外光谱分析技术针对灵芝质量的检测主要集中在几种比较常见的原料上,如水果、粮油、茶叶等,一些保健品原料却少有人研究或者刚处于起步阶段。
实际生产生活中能够接触使用到的便携式近红外质量检测设备极其少见。
4.研究展望
经过半个世纪的发展,近红外光谱检测分析技术已经逐步成为一种快速方便的分析技术。
高效方便的近红外光谱快速分析技术已经悄然走入各个领域,不断地改善着实验室的分析条件和分析状况,在线近红外光谱分析的应用已给灵芝质量加工业和其他工业带来巨大的经济效益和社会效益。
由于近红外光谱技术具有快速、无损、无试剂分析、高效、安全、检测成本低及多组分同时测定等特点,使之必将成为灵芝质量无损检测试验最经济有效且最具发展前景的检测分析技术之一[43]。
结合目前灵芝质量近红外无损检测的研究现状来看,未来将主要从以下几个方面展开研究。
(1)相对于传统化学分析方法需要添加试剂耗时、费力、不安全、破坏性、成本高,许多检测设备体积庞大、缺乏可移动性,实时实地检测比较困难,尤其是对灵芝生长过程中的品质检测造成了很多不确定的因素[44]。
采用近红外无损检测分析技术的灵芝质量便携式检测仪因为具有方便、快捷、实时以及高效的特性,在今后的农业、质检部门以及灵芝加工企业将具有很大的发展前景。
(2)由于建立稳定的灵芝质量近红外分析检测数学模型是一个相当复杂的过程,在这一过程中必然要用到大量的分析软件、化学计量学处理方法以及相应的辅助手段。
将这些分析方法,样品资源以及研究人员的经验技能形成一个综合的,具备模拟性的系统开发软件,形成数字化、模式化的并且易于掌握的定标模型校正软件,实现品质模型特征数据库资源共享和不同灵芝校正模型之间移植转换,模型对接将是开发研究人员在以后几年内需要解决的问题。
(3)随着近红外分析的适用领域不断扩大和发展,对于环境监测和灵芝检测的工业环境中急需采用远程和在线分析测量,甚至有的环境下需要极小的检测探头。
这给光纤传输技术在近红外光谱分析中的应用提供了发展空间,同时也促进了光纤工艺对近红外光谱测量仪器整体结构的改变。
光纤导管、光纤探头等的开发应用,使远距离检测成为了现实。
远距离检测技术尤其适用于污染严重、高压、高温等对人体和仪器有损害的环境下的应用,也为近红外网络技术的发展奠定了基础[45]。
随着近红外光谱分析技术应用的不断深入,近红外光谱分析技术必然将向科学化、定量化、数字化和网络化转化,实现近红外分析评价系统的实时跟踪与升级,从而帮助和加强系统的策略分析和综合评估,为灵芝质量的加工管理提供决策支持,推进灵芝质量分析检测的数字化和信息化向前迈进。
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