第十三章精液斑检验文档格式.docx
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空泡状顶体覆盖了精子细胞核的前2/3,内含多种水解酶,如顶体蛋白酶、透明质酸酶、酸性磷酸酶等,在受精时有利于精子穿透卵子外周的放射冠与透明带而进入卵内。
精子细胞核除含有染色质外,还含有各种大小的空泡。
尾部长达40~60μm,细长而弯曲。
分为颈段、中段、主段和末段四部分。
受精时,仅头部进入卵细胞,即使有少量线粒体鞘内的mtDNA也进入卵子,其与卵子所含的上万数目的mtDNA相比,几乎对基因型不产生影响,故mtDNA呈母系遗传。
(三)精液斑的特点
1.定义:
精液斑是精液浸润或附着于基质上,干燥后形成的斑痕。
2.精斑存在的位置:
精斑多附着于犯罪嫌疑人或被害人的衣、裤上,女性的外阴部或大腿内侧,现场的被褥、毛巾、纸张、草席、床板、沙石、泥土等。
此外,阴道擦拭物也是常见的精斑检材。
精斑无固定的形态,外观常因附着物不同而有差异新鲜精斑有特殊腥气味:
(1)在体表,精斑常呈白色鳞片状痂片。
(2)在深色纺织品上,浓厚精斑呈灰白色浆糊状斑迹,偶可见结痂;
较稀薄的精斑浸润于布纤维间,则不易察见。
(3)在浅色纺织品上,精斑多呈黄白色地图状,边缘色深。
用放大镜检查,可在布纤维表面或中间见黄白色小鳞片。
(4)在软质载体,如衣、裤、纸张上的精斑手触之有硬感。
二、精斑检验的目的与要求
1.精斑检验的主要目的:
为案件的侦查提供线索,为分析、审理案件提供证据。
2.对疑为精斑的检材需要解决下列问题:
可疑斑痕是否为精斑?
若是精斑,确定精斑的个体来源。
检验步骤为:
肉眼观察、预试验、确证
3试验、认定为人精斑后测定遗传标记,进行个体识别。
三、精斑的肉眼检验
肉眼检查的目的:
是发现可疑精斑,确定所在部位及分布,以便准确取材检验,提高阳性率。
有时可根据精斑的形态、部位分析有关作案过程。
(1)典型的精斑:
呈不规则地图状。
观察并记录斑迹的分布情况、数目、位置、形状、大小、颜色及光泽等。
新鲜精斑触之有干浆糊斑状的硬感,有特殊的腥味。
(2)水洗、雨淋后的,或有色基质上的精斑肉眼比较难观察。
可将检材置于紫外光下于暗处观察。
紫外线检查:
精斑中含有黄素(flavin),在紫外线照射下显银白色荧光,斑痕边缘呈浅紫蓝色。
水洗过、肉眼不能发现的精斑,在紫外线下仍发浅淡的点片状荧光。
注意:
阴道分泌物、尿液、鼻涕、唾液、乳汁、脓液、肥皂斑、洗涤剂、植物汁液、纺织品中的某些色素、染料、漂白剂、含荧光素的各种载体等在紫外线下也能发与精斑类似的荧光,故紫外线检查阳性结果仅表示斑痕可能是精斑。
精斑过于淡薄,数天或者数年的精斑,可无荧光,故阴性结果不能轻易否定精斑。
优势:
紫外线检查方法简便,不损害检材,不影响检材作其他项目的检验。
一般在肉眼不易辨别时作精斑定位用。
四、精斑的预试验
预试验的目的:
是筛选可疑精斑,故要求方法简单,灵敏度高。
精斑预试验方法很多,常用的方法如下:
一、酸性磷酸酶检验
精液的主要成分前列腺分泌液中含有大量酸性磷酸酶(acidphosphatase,ACP),浓度为540~4000u/ml,较其他体液、分泌液及脏器的含量高100倍以上。
除精液外,部分蔬菜、水果也含少量酸性磷酸酶。
此外,某些避孕药ACP检测也呈弱阳性反应。
故该试验只能作为精斑的预试验。
由于酸性磷酸酶来源于前列腺,无精子的精液ACP试验也呈阳性结果。
精斑中酸性磷酸酶相当稳定,对腐败及高热有较强的抵抗力。
保存10余年的陈旧精斑,夏日室温放置8周的腐败精液及125℃加热30min的精液仍能检出其酶活性,但200℃加热5min则破坏ACP酶活性。
常用磷酸苯二钠显色试验检测酸性磷酸酶。
(一)磷酸苯二钠试验(Kind-King试法)
1.原理:
精液中的酸性磷酸酶可分解磷酸苯二钠,产生萘酚,后者经铁氰化钾作用并
与氨基安替比林结合,生成红色醌类化合物。
2.试剂:
由反应缓冲液和显色液两部分组成。
缓冲液:
磷酸苯二钠0.2g,4-氨基安替比林0.6g,柠檬酸1.4g,1mol/L氢氧化钠12.5ml,蒸馏水加至100ml,加热溶解后置冷水中迅速冷却,加0.5ml氯仿。
显色液:
铁氰化钾3.6g,1mol/L氢氧化钠16.7ml,碳酸氢钠1.4g,蒸馏水加至100ml。
3.方法:
取可疑斑痕0.1cm×
0.1cm,最好取斑痕边缘部位,置试管内,加缓冲液3~4滴,经37℃温箱内5-10min后,加等量显色液,立即出现红色为阳性反应,表明检材可能是精斑。
颜色深浅与酸性磷酸酶浓度呈正比,浓度愈高,颜色愈深红,浓度过高可出现红色沉淀。
呈橙黄色为阴性反应,表明检材不是精斑或精斑中的酸性磷酸酶被破坏。
同时剪取无斑痕处检材及己知精斑作阴性与阳性对照。
4.评价:
(1)磷酸苯二钠试验灵敏度较高,稀释20000倍的精液仍呈阳性反应。
被水洗过的淡薄精斑,只要适当延长缓冲液浸泡时间可呈阳性结果。
精液如混有血液并不影响检验,血痕在该试验中呈灰褐色。
由于该试验灵敏度很高,所以操作时,一般按空白部位、可疑精斑、己知精斑的顺序剪取检材,避免污染。
(2)酸性磷酸酶试验的特异性较差,1g内脏组织如肺、肝、肾、心、胃等,用5ml缓冲液浸泡的浸液以及常见的人体分泌物或者排泄物如鼻涕、汗、唾液、成年男性尿液等也可呈弱阳性反应。
为了排除上述假阳性反应,可在显色后将液体稀释64倍或将试管再放入56℃温箱中10~20min,此时精斑仍维持红色,引起假阳性的红色消褪。
(3)所有的预试验中除酸性磷酸酶检验外,其他各项试验灵敏度均不高,因此精斑检验和血痕检验不同。
实际上精斑不一定要经过预试验后才进行确证试验,可剪取肉眼可见的斑痕直接进行确证试验。
有时预试验阴性的检材还是要进行确证试验,偶有磷酸苯二钠试验阴性,而查见精子的报道。
五、精斑的确证试验
精斑确证试验的目的:
检验精液中的特有成分,阳性结果可以确证精斑。
精斑确证试验方法很多,主要有以下两类方法:
精子检出法和免疫学方法。
一、精子检出法
检出精子是认定精斑最简便、最可靠的方法,不需要特殊试剂和仪器。
精子具有典型而稳定的形态,不易受其他因素影响而改变。
在显微镜下观察到典型精子,即能确证人精斑。
精斑中的精子形态相当稳定,十余年的陈旧精斑也可能查见精子。
镜下观察精子是无色的,一般情况下精子头部有折光,尾部很细。
检材浸泡后涂片观察,常见精子头部和尾分离。
只要检见典型的精子头,也可以确证精斑。
在实际的精斑检验中,常选择合适的浸液及适当的染色方法,以提高精子的检出率。
⒈检材处理取可疑精斑检材1.5cm×
1.5cm,剪碎,置试管内,加约0.5ml生理盐水,室温2h,可用玻棒搅拌和压挤检材。
然后置4℃过夜,吸出全部浸液置另一试管内,2500r/min离心5min,上清液留作抗人精液沉淀反应和中和试验。
沉淀物涂片,干燥后甲醇固定5min,染色,检验精子。
过于陈旧的精斑,盐水浸渍不易分离精子,可用5%~10%氨液浸渍,或用0.8%盐酸、醋酸、胰蛋白酶等浸渍,12~24h后弃载体纤维,离心。
沉淀经洗涤后涂片、染色、镜检。
⒉染色方法精子染色方法有单染法和复染法两种。
(1)单染法
使用的染料有藻红、亚甲蓝、苏木素等,其中以藻红染色效果较好。
单染法操作简单,但精子和基质都染成同一颜色,不容易观察。
藻红染色法:
取藻红0.5g,溶于25%氨水100ml配制成藻红染色液。
在涂片上滴加1~2滴染色液,室温下染色3~5min,水淋洗,干燥后二甲苯透明,高倍镜检查。
精子头部和尾部均染呈红色。
亚甲蓝染色法(Loffler法):
亚甲蓝0.3g,加95%乙醇30ml,0.01mol/LKOH70ml,配制成亚甲蓝染色液。
于涂片上滴加1~2滴染色液,染色1min,水洗,二甲苯透明,盖上盖玻片镜检。
精子头后部染呈深蓝色,头前部、尾部不着色或浅染。
(2)复染法
复染法使用2种或2种以上染料,所以精子头部、尾部和基质染成不同的颜色,便于观察和分辨。
有HE染色法、酸性品红亚甲蓝染色法。
其中以酸性品红亚甲蓝染色法常用。
苏木素伊红(HE)染色法
染色试剂有三种:
A.苏木素染液,称取苏木素0.5g,用无水乙醇5ml溶解。
取明矾10g,在蒸馏水中加热溶解,加入苏木素乙醇液,加热至溶液呈深紫色,加入氧化汞0.25g,迅速冷却。
B.0.5%伊红染液。
C.1%盐酸酒精溶液,取盐酸1ml,加70%酒精至100ml。
染色方法:
在涂片上滴加1~2滴苏木素染液,染色10~30min。
水淋洗后,加1%盐酸酒精5~10s,水洗或在水中浸泡30min后,加伊红染液3min,水淋洗。
干燥后二甲苯透明,镜检。
精子头前半部不着色或浅染,后半部染呈蓝色,尾部染呈红色。
酸性品红亚甲蓝(Baecchi)染色法
染色液:
由1%酸性品红液1ml,1%亚甲蓝81ml,1%盐酸40ml组成。
于涂片上滴加染色液,静置5min,用1%盐酸漂洗,干燥后二甲苯透明,镜检。
精子头部呈红色,尾部蓝色。
本法仅精子染色显著,其他杂质染色浅淡,有利于精子的检出。
显微镜下检见精子需要一定的经验,精斑陈旧、取材部位不准或遇到少精子症者,涂片上往往仅见少量精子,故染色后须仔细地观察,只要找到一个完整的典型精子,即能确证人精斑。
精斑在浸渍处理过程中,精子尾部断落,常只检见精子头部,应与阴道滴虫、酵母菌等鉴别。
典型的精子头部呈椭圆形,着色特殊,其它植物细胞、细菌、阴道滴虫等则多呈圆形,染色均匀一致。
若发现几个典型的精子头部也可确证为精斑。
3.精子的检出时间
性交后精子可以存活一段时间,一般情况下阴道内3~8h,宫颈2~5天,子宫、输卵管内1~10天的拭子内容物涂片可检见活精子。
阴道内3~9天,宫颈17天的内容物涂片可检见死精子。
精子的检出期限与被害人的体位、活动情况以及月经周期有关。
被害人处于月经期前后或被强奸后就行走,精子检出期限短。
在性犯罪调查中,取阴道拭子的时间越早越好,如果在24h后取材阴道拭子,精子检测阳性率下降50%,48h取材,阳性率仅10%。
活体阴道拭子,精子检出期限一般1.5~2天。
若被害人死亡,尸体处于仰卧位,则检出期限较长,阴道拭子中精子不仅数目多、而且形态基本完整,最长的检出期限可达3周。
而冰冻2个半月的尸体,宫颈涂片偶能检出精子。
精子检出率也与阴道拭子提取方法与部位有关,例如宫颈刮片和阴道后穹窿部擦拭物精子的检出率较高。
二、免疫学试验
制备各种抗人精液特殊成分的抗血清,用免疫学试验,如沉淀反应、酶联免疫吸附试验、胶体金标记试验等检测相应抗原,可以确证精斑。
该试验灵敏度高,还可以确证输精管结扎术者和精子缺乏症患者的精斑。
常用的有抗人精液血清和抗-p30血清进行的反应。
1.胶体金法
胶体金法是一种免疫层析技术,用胶体金p30抗原检测试剂条,又称PSA(prostatespecificantigen)试剂条进行精斑确证试验,特异性好,灵敏度高,稀释6000倍的精液仍可获阳性结果。
另外,试验操作简单,整个试验过程可在5min内完成,是目前一项常规技术。
(1)原理及方法
精斑确证试验胶体金标记的是鼠抗人p30单克隆抗体,检测线包被有另一种鼠抗人p30单克隆抗体,质控线包被有羊抗鼠IgG抗体。
精斑确证试验在实际工作中可联合使用,如精子检查及抗人精液血清环状沉淀试验均得阳性结果,可以认定精斑,如果二者均为阴性结果,可以否定精斑。
六、精斑的个人识别
精斑检验的主要目的:
是进行个人识别,确定现场精斑是谁所遗留。
目前精斑个人识别的方法己取得了很大的进展。
精斑检验传统的遗传标记主要有ABO血型、酶型、血清型等,但是DNA多态性的应用发展很快,应用价值最大。
(一)精斑的ABO血型测定
ABH血型物质以水溶性形式存在于人的体液、分泌液中,属糖蛋白。
分泌型人精液中ABH血型物质与唾液中含量相似,常用中和试验检测;
非分泌型精液由于ABH血型物质含量少,需用灵敏的ELISA法检测。
1、中和试验
中和试验是一种检测可溶性血型物质的传统方法。
【试验原理】
红细胞凝集抑制试验。
精斑检材中可溶性血型抗原与相应的抗体结合,使抗体的效价下降或消失,凝集红细胞的能力下降或消失。
用已知型别指示红细胞检测中和后的抗体效价,凝集能力下降或消失,红细胞不凝集为试验阳性,说明精斑检材具有相应的血型抗原。
【结果说明】
精斑中ABH物质量必需与相应抗血清中所含的抗体量相当,才能完全中和抗体,获得准确的结果。
因此传统的中和法是一种半定量检测,需要将精斑浸液作一系列的稀释度,各稀释液含有不同量的ABH抗原,能充分中和标化抗血清中的抗体,再加指示红细胞。
精斑检材分别与抗-A、抗-B抗体及抗-H试剂作中和试验,综合三者反应结果,判定分泌型精斑的ABO血型及分泌能力的强弱。
【方法】
抗血清效价标定
取12凹白瓷板一块,以2滴抗血清加2滴生理盐水作2-4倍数系列稀释,直至1/2048。
笫12凹为空白盐水对照。
向每凹加入1滴2%指示红细胞悬液,摇匀,室温置30min,观察结果。
能使红细胞凝集的抗体最高稀释倍数即为该抗血清的效价。
若抗血清的效价为128时,要将之标化为2,应该稀释64倍。
中和试验
取精斑0.5cm2,剪碎置小试管内,加0.5ml生理盐水,搅拌后室温下2h,4℃冰箱中过夜。
取精斑浸出液,在白瓷板内分三列用生理盐水作倍量稀释,稀释度由1/2至1/128。
于三列稀释液中分别加入等体积的效价为1:
2的抗-A、抗-B抗体及抗-H试剂,摇匀,室温下中和30min。
再向三列各凹加入2%指示红细胞悬液各1滴,摇匀后静置30min,观察红细胞凝集情况。
以己知ABO血型的分泌型人唾液作阳性对照,以检材无斑痕部分作阴性对照。
在己知对照正确的情况下,精斑检材与无精斑检材的抑制凝集相差3级以上,证明精斑中含有相应的血型物质,综合抗-A、抗-B及抗-H中和的结果,判断精斑的ABO血型。
凝集抑制级数的多少在一定程度上可推测精斑中所含各种血型物质的量,判断分泌能力的强弱,并能区分分泌型与非分泌型。
在实际检案中,确定分泌能力对排除某些嫌疑对象有一定的参考价值。
【注意事项】
中和试验操作简单,灵敏度较高。
在检测中一般不会出现假阳性结果,但假阴性值得注意。
抗血清的效价要准确标定,通常采用效价为1:
4或1:
2的抗血清,抗血清效价过高易导致假阴性结果。
浸泡检材的生理盐水不宜过多,检材浸液与抗血清中和时间至少30min以上等都可以减少假阴性。
检材浸出液混浊时,可水浴煮沸10min,离心,以除去蛋白、细菌、酶类等干扰。
2、DNA分型
用PCR-RFLP法测定,能区分精子的6种ABO基因型,灵敏度为0.1μl精液,不受分泌状态的影响。
DNA分型明显提高了ABO血型在精斑个体识别中的应用价值。
(二)DNA分析
精子含有大量DNA,可从精子提取DNA,检测其多态性。
既使精液中无精子,由于精液中含有少量睾丸细胞、上皮细胞等,也能进行DNA分型。
精子细胞核是富含二硫基的交联蛋白组成的网状结构,能抵抗各种类型的去污剂作用,对外源性蛋白酶水解也有相当强的抵抗作用,必须在DTT等试剂的作用下,使二硫基断裂,还原成-SH,核蛋白才能被SDS、蛋白酶K分解,释放出DNA。
精子核蛋白在没有还原剂时极为稳定,在还原剂存在时不稳定,利用这种特性可用差异裂解分离法(differentiallysis),又称二步消化法从精液与阴道液的混合斑中提取精子DNA。
二步消化法:
第一步消化:
在检材中加入TES液400ml,10%SDS40ul,10mg/ml蛋白酶K10ul,56℃水浴2h。
取出,用TES液洗涤,离心,10000rpm,10min.重复洗涤3次。
其目的是去除检材中的杂蛋白和女性成分等,这一步的目的是将女性成分去除的越干净越好。
第二步消化,取第一步消化的沉渣,用Chelex-100法加DTT或者用有机法加DTT进行提取。
此步的目的主要是提取男性的DNA。
精斑基因组DNA多态性分析目前多采用PCR技术,在血痕中能测定的基因座几乎都能用相同的方法在精斑中测定,包括位于常染色体和Y染色体上的VNTR、STR基因座,一些红细胞血型、HLA型、酶型和血清型的基因型等。
由于Y染色体系男性所特有,故Y-DNA多态性测定在性犯罪案的精斑个人识别中有独特的应用价值。
Y染色体DNA多态性主要有两类:
STR多态性及VNTR多态性。
Y-STR的检验方法与常染色体STR基因座的检验方法一样,可以是单基因座扩增,也可
采用多基因座复合扩增。
Y-STR各座位等位基因在遗传时是连锁的,以单倍型遗传。
由于检测Y-STR不需要分离男女成分即可实现对男性成分的基因分型,故在性犯罪案件中,对精液与阴道液组成的混合斑中精液的个人识别有极其重要的意义。
Y-STR呈男性伴性遗传,不与其他染色体重组,除突变外,在父系的所有男性个体中,包括兄弟、父子、叔侄、堂兄弟和祖孙等都具有相同的Y-STR单倍型。
因此Y-DNA标记作个人识别只具有排除同一性意义,没有认定同一性的作用。
第二节精液斑检验案例
精液(斑)检验是法医物证学的一项主要内容,在法医学鉴定实践中,与血痕检验占有同等重要地位,特别是对有关性犯罪或有性犯罪嫌疑的案件,精液(斑)的检验显得尤为重要,DNA检验结果成功与否,直接决定着此类案件的定性与侦破,所以,检验此类案件时要特别仔细﹑谨慎。
案例一
【案情简介】
某年某月某日,某市一四岁女孩被强奸。
由于阴道严重损伤,大量出血,回家后女孩的母亲将其粘有大量血迹的裤子换下放入一大盆内放水浸泡准备清洗,接案后,技术人员要求其不准动盆内的水,将盆内约10公斤水提回。
经多次沉淀,最后将沉淀镜检,检出大量精子。
【实验室检验】
将盆内的水约10公斤,经多次沉淀,最后将沉渣涂片,干燥后用甲醇固定10min,干燥后,于涂片上滴加2滴酸性品红亚甲蓝染色液,静置5-10min,用1%盐酸漂洗,干燥后二甲苯透明,镜检。
镜下见到精子头部呈红色,尾部蓝色,检见少量精子。
经两步法提取精子DNA,PCR-STR分析,得到精子和嫌疑人的STR基因型,其基因分型完全一致,从而认定了嫌疑人。
【启示】
在本案中检材被已被大量稀释的情况下,技术人员仍未放弃检验,根据精子在水中不会被裂解而是沉淀的特性,最终经浓缩的方法得到了精子,通过检测精子的基因型与犯罪嫌疑人进行比对,以认定犯罪嫌疑人。
案例二
某年某月某日,某市发生一起强奸案,被害人陈某被李某强奸,侦查人员将案件相关检材送到实验室进行检验。
剪取被害人陈某内裤1cm2、陈某阴道擦拭物少许、犯罪嫌疑人李某阴茎擦拭物少许分别放入三只离心管中,分别加1ml的生理盐水浸泡,室温2小时,冰箱过夜,第二天取出,反复挤压,取上清离心,10000rpm,5min,上清用胶体金p30抗原检测试剂条(PSA)检测,结果陈某内裤及阴道擦拭物PSA反应均为阴性反应,李某阴茎擦拭物PSA反应为阴性反应。
沉渣涂片,干燥后用甲醇固定10min,干燥,在涂片上滴加2滴酸性品红亚甲蓝染色液,静置5-10min,用1%盐酸漂洗,干燥后二甲苯透明,镜检。
结果陈某内裤及阴道擦拭物镜下未见到精子,李某阴茎擦拭物镜下检见精子。
提取李某阴茎擦拭物、被害人陈某、嫌疑人李某的DNA,经PCR-STR分析,得出李某阴茎擦拭物、被害人陈某和嫌疑人李某的STR基因型,经比对李某阴茎擦拭物与被害人陈某的STR基因型完全一致,使这起强奸案得以侦破。
在本案中,现场物证没有发现精斑,通过询问被害人了解到,李某在实施强奸行为时,阴茎与被害人的身体有接触,男性生殖器上很可能会有女性阴道上皮细胞附着,可以通过对嫌疑人阴茎擦拭物进行DNA分析,试图检出被害人的生物成分的基因型,从而与被害人生物成分的基因型进行比对得到可靠的证据。
案例三
某年某月某日,某市受害人李某(7岁)被嫌疑人王某(65岁)猥亵,嫌疑人王某用手指抠其会阴部,致使受害人会阴部红肿,处女膜破裂。
由于嫌疑人拒不交待,在这种情况下,技术人员用拭子擦拭受害人李某会阴部提取嫌疑人王某可能留下的上皮细胞,提取嫌疑人王某血样、受害人李某会阴部拭子的DNA,用Y-STR试剂盒检出两份检材的Y-STR基因型,经比对受害人李某会阴部拭子与嫌疑人王某的Y-STR基因型一致,排除嫌疑人王某家族其他男性作案的可能,从而认定嫌疑人王某的罪行,在证据面前,嫌疑人王某交待了犯罪事实,从而成功破获此案。
在本案中,技术人员利用Y染色体PCR-STR技术在女性成分很高的背景下(女性与男性检材的混合比例可能高达2000:
1时),Y染色体PCR-STR分析仍不受影响这一特性,为案件的诉讼提取供了科学的证据。
另外,本案严格来讲是对嫌疑人手指脱落上皮细胞的检验,不应归入精斑类,但由于Y染色体PCR-STR
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- 第十三 精液 检验
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