凯氏定氮法实验报告Word下载.docx
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凯氏定氮法实验报告Word下载.docx
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一、【实验目的】
1.掌握凯氏(Kjeldahl)定氮法测定蛋白质含量的原理和方法
2.学会使用凯氏定氮仪
二、【实验原理】
凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸共热,经一系列的分解、碳化和氧化还原反应等复杂过程,最后有机氮转变为无机氮硫酸铵,这一过程称为有机物的消化。
为了加速和完全有机物质的分解,缩短消化时间,在消化时通常加入硫酸钾、硫酸铜、过氧化氢等试剂,加入硫酸钾可以提高消化液的沸点而加快有机物分解,硫酸铜起催化剂的作用。
使用时常加入少量过氧化氢作为氧化剂以加速有机物氧化。
消化完成后,将消化液转入凯氏定氮仪反应室,加入过量的浓氢氧化钠,将NH4+转变成NH3,通过蒸馏把NH3驱入过量的硼酸溶液接受瓶内,硼酸接受氨后,形成四硼酸铵,然后用标准盐酸滴定,直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。
滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数,通过计算即可得出总氮量。
在滴定过程中,滴定终点采用甲基红-次甲基蓝混合指示剂颜色变化来判定。
测定出的含氮量是样品的总氮量,其中包括有机氮和无机氮。
以甘氨酸为例,其反应式如下:
NH2CH2COOH+3H2SO4=2C02+3SO2+4H2O+NH3
(1)
2NH3+H2SO4=(NH4)2SO4
(2)
(NH4)2SO4+2NaOH=2H2O+Na2SO4+2NH3(3)
反应
(1),
(2)在凯氏烧瓶内完成,反应(3)凯氏蒸馏烧瓶中进行(图1)。
蛋白质是一类复杂的含氮化合物,每种蛋白质都有其恒定的含氮量(约在14%~18%,平均为16%)。
凯氏定氮法测定出的含氮量,再乘以系数6.25,即为蛋白质含量。
三、【试验器材】
1.卵清蛋白
2.凯氏定氮仪
3.电炉
4.消化架
5.锥形瓶100ml(×
5)
6.量筒10ml(×
1)
7.滴定管(5ml,可读至0.02ml)
8.凯氏烧瓶(×
2)
9.玻璃珠
10.吸耳球
11.移液管(2ml,5ml,10ml×
1)
四、【实验试剂】
1.卵清蛋白溶液:
2g卵清蛋白溶于0.9%NaCl溶液并稀释至100ml。
如有不溶物,离心取上清液备用。
2.浓硫酸(A.R.)
3.硫酸钾-硫酸铜混合物:
硫酸钾3份与硫酸铜1份混合研磨成粉末。
4.30%氢氧化钠溶液:
30g氢氧化钠溶于蒸馏水,稀释至100ml。
5.2%硼酸溶液:
2g硼酸溶于蒸馏水,稀释至100ml。
6.混合指示剂:
0.1%甲基红乙醇溶液和0.1%甲烯蓝乙醇溶液按体积比4:
1混合。
7.0.00963mol/L标准盐酸溶液:
用恒沸盐酸准确稀释标定。
五、【实验操作】
1.样品的消化
将两个50mL的凯氏定氮烧瓶编号(在烧瓶口附近),一只烧瓶内加1.0mL蒸馏水,作为空白。
另一只烧瓶内加入1.0mL样液(卵清蛋白液)。
然后用取样器各加浓硫酸4mL(取浓硫酸时勿溅到衣物和皮肤上,也不要洒到实验桌上),用药勺加硫酸钾-硫酸铜混合物约200mg(不必称重,一点点即可),所有试剂要尽量加到凯氏定氮烧瓶的底部。
烧瓶口插上小漏斗(作冷凝用),烧瓶置通风橱内的电炉上加热消化,注意先启动抽风机在消化开始时,应控制火力,不要使沸液冲到瓶颈。
待瓶内水汽蒸完,硫酸开始分解并放出SO2白烟后,适当加强火力,继续消化,直至消化液呈透明蓝绿色为止。
消化时间为2~3h,冷却,准备蒸馏。
在消化时可以同时进行第二步。
2.定氮仪的洗涤
仪器应先经一般洗涤,再经水蒸气洗涤。
蒸气发生器中装加有H2SO4的蒸馏水和数粒沸石,加甲基橙指示剂后显粉红色。
加热后,产生的蒸汽经贮液管、反应室至冷凝管,冷凝液体流入接受锥形瓶瓶。
每次使用前,需用蒸汽洗涤5分钟左右(此时可用一小烧杯承接冷凝水)。
将一只盛有5mL2%硼酸液和1~2滴混合指示剂的锥形瓶置于冷凝管下端,使冷凝管管口插入液体中,继续蒸馏3分钟,如硼酸液颜色不变,表明仪器已洗净。
若硼酸的颜色变为淡绿色,说明定氮仪内有残留氨,需要进一步用蒸汽洗涤。
若反应室内有上次操作剩余的残夜,
3.标准品练习(标准硫酸铵溶液,含氮量0.3mg/ml)
仪器洗好后,取一100ml锥形瓶,加入5ml硼酸溶液,并使冷凝管下端玻璃管插入硼酸溶液中。
取下棒状玻璃塞,利用2ml移液管准确向反应室加入2ml硫酸铵溶液,然后将玻璃塞放回,向玻璃杯中加入10ml30%NaOH溶液,旋转棒状玻璃塞,将氢氧化钠溶液缓慢地放入反应室中,并留少量液体作水封。
等到锥形瓶内的硼酸溶液由紫红色变为鲜绿色后开始计时,继续蒸馏3min,然后移动锥形瓶使液面离开冷凝管口约1cm,继续蒸馏1min。
并用少量蒸馏水洗涤冷凝口外围,移去锥形瓶。
立即用标准盐酸溶液进行滴定,如果用滴定结果计算出的标准硫酸铵中氮含量接近于0.3mg/ml。
则说明整个实验操作正确,可以进行下一步。
4.样品测定
取下11棒状玻璃塞,利用2ml移液管准确向反应室加入2ml消化好的样品溶液,然后将玻璃塞放回,向7玻璃杯中加入10ml30%NaOH溶液,旋转棒状玻璃塞,将氢氧化钠溶液缓慢地放入反应室中,并留少量液体作水封。
立即用标准盐酸溶液进行滴定,按上述方法洗涤仪器准备下一次蒸馏。
重复蒸馏并滴定三次。
将2ml消化好的样品溶液改为2ml消化后的空白对照溶液,其他操作同上,测量三组。
三组空白测量中,若锥形瓶中的硼酸溶液不变色,则无需滴定。
六、【注意事项】
1.凯氏法的优点是适用范围广,可用于动植物的各种组织,器官及食品等成组复杂样品的测定,只要细心操作都能得到精确的结果。
其缺点是操作比较复杂,含有大量碱性氨基酸的蛋白质测定结果偏高。
2.普通实验室中的空气中常含有少量的氨,会影响结果,所以操作应在单独洁净的房间中进行,并尽可能快地对硼酸吸收液进行滴定。
3.定氮仪各连接处应使玻璃对玻璃外套橡皮管绝对不能漏气。
蒸馏时需控制火力以避免样液倒吸。
4.消化时,若样品含糖高或含脂及较多时,注意控制加热温度,以免大量泡沫喷出凯氏烧瓶,造成样品损失。
可加入少量辛醇或液体石蜡,或硅消泡剂减少泡沫产生。
5.消化时应注意旋转凯氏烧瓶,将附在瓶壁上的碳粒冲下,对样品彻底消化。
若样品不易消化至澄清透明,可将凯氏烧瓶中溶液冷却,加入数滴过氧化氢后,再继续加热消化至完全。
6.蒸馏时,加入的氢氧化钠溶液除与硫酸铵作用外,还与消化液中的硫酸和硫酸铜作用。
若加入的氢氧化钠不够,则溶液呈蓝色,不生成褐色的氢氧化铜沉淀。
所以,加入的氢氧化钠必须过量,并且动作还要迅速,以防止氨的流失。
7.蒸气发生瓶内的水装至2/3体积并且保持酸性(在蒸气发生瓶内的水中加入稀硫酸,使之呈酸性,内加甲基橙指示剂数滴,水应呈橙红色,如变黄时,应该补加酸),以防止在碱性条件水中游离氨蒸出,使结果偏大。
8.因蒸馏时反应至外层的气压大于反应室内的压力,而反应室的压力大于大气压力,故可将氨带出。
所以,蒸馏时,蒸气要均匀、充足,蒸馏中不得停火断气,否则,会发生倒吸。
停止蒸馏时,由于反应室外层的压力突然降低,可使液体倒吸入反应室外层,所以,操作时,应先将冷凝管下端提高液面并清洗管口,再蒸1min后关掉热源。
七、【实验结果】
1.结果
表一各组实验消耗的标准盐酸体积(ml)
1
2
3
平均
标准品练习
4.40
空白1
0.09
0.13
0.11
样品3
2.75
2.92
2.86
2.84
2.计算
m=
式中m:
样品中的含氮的质量,即100ml样品中含氮量(mg)
A:
滴定样品消耗的HCl溶液体积(ml)
B:
滴定空白消耗的HCl溶液体积(ml)
V:
相当于未稀释样品的体积(ml)
c:
盐酸物质的量浓度(mol/L)
14.008:
每摩尔氮原子质量(g/mol)
100:
100ml样品
所以可得:
1.标准硫酸铵中的N含量:
=0.297mg
该结果与标准值的相对误差=(0.297—0.3)/0.3×
100%=1%,这表示我们整个的实验操作正确。
2.蛋清中N含量(100ml样品):
m=
=18.41mg
3.若样品中含氮物均为蛋白质,则蛋清样品中蛋白质的含量为:
18.41×
6.25=115.063mg
八、【结果分析及讨论】
1.分析:
1.在测量标准硫酸铵中含氮量时,我们测得的结果为0.297mg/ml,而标准值为0.3mg/ml,相对误差为1%,这说明我们组的实验仪器状态良好,而且操作也是正确规范的。
2.在测定样品中氮含量时,我们的测定结果为18.41mgN/ml,而且三组测量数据的相对偏差分别为2.55%,2.23%,0.76%,可见相互之间偏差很小,即实验准确性较高。
由此推出实验室提供样品含氮量也应该在18.41mgN/ml左右。
2.讨论:
本实验定氮的目的是确定样品中蛋白的含量,使用凯氏定氮法测定蛋白含量具有许多优点。
该方法可用于食品的蛋白质分析,操作相对比较简单,实验仪器和实验试剂相对比较便宜,并且结果准确,是一种测定蛋白质含量的经典方法。
但本方法最大的缺点在于最终测定的是总氮,而不仅仅是蛋白质氮,并且实验的时间太长,关于这一点在本次实验中深有体会。
除了凯氏定氮法,测量蛋白含量常用的方法还有双缩尿法、Folin-酚试剂法和紫外吸收法。
其中Folin-酚试剂法在先前的实验中已经做过,这种方法灵敏度高并且操作简便、快速,但准确度相对不高,且有的检测不可用。
每一种方法都有其优点与不足,方法的选择要由实际情况来定。
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