酵母菌的分离筛选方法文档格式.docx
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100g黄豆芽,加水煮沸30min,纱布过滤,补足蒸馏水1L
1.6察氏培养基:
主要培养霉菌观察形态用
蔗糖30g/L硝酸钠3g/L磷酸氢二钾1g/L氯化钾0.5g/L硫酸镁
0.5g/L硫酸亚铁0.01g/L琼脂15-20g/L121℃20minPH自然
一般分离黄酒酵母酒精酵母使用曲汁培养基,啤酒酵母用酒花麦汁培养基,葡萄酒酵母用葡萄汁培养基。
2.集菌:
研究酵母菌生态和某种基物或样品中的酵母菌区系,一般不进行集菌,以免改变其中不同种类数量间的对比,将样品制成菌悬液按常规法分离。
若从样品中分离特定种类时先集菌。
集菌发酵力强菌株,加酸性含糖的培养基,酸性豆汁,必要时注入高浓度的酒精(13-17%),霉菌在液体中形成菌丝体,酵母不形成菌丝,25-28℃2-3d,遇到菌丝体用接种环挑去烧掉,去掉上清液,取沉淀酵母一至两环移植另一液体培养基中,集菌连续两至三次才能完成,要配合镜检。
实例:
将待分离的样品10g(ml)放入90ml无菌水或生理盐水/150ml三角瓶(玻璃珠),摇床振荡20-30min,取上清液接种于酸性培养液(乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基酸性麦芽汁或酸性豆芽汁)25-28℃2-3d,培养过程中若出现菌丝体跳出烧掉,集菌连续两至三次,培养液变成混浊,产生菌膜和沉淀物。
镜检:
美兰染液染色,活菌可还原美兰染液,菌体无色。
3.筛选:
分离:
取集菌液适当稀释,吸取0.1-0.2ml梯度菌液(至少两个两个平衡),涂布于马铃薯-葡萄糖麦芽汁或虎红培养基平板,也可采用混菌法或蘸取集菌菌液直接划线,(平放12h后倒置培养),25℃培养48h,低温酵母菌15℃高温酵母菌35℃40℃45℃,形成清晰菌落。
在培养皿底划分小方格,待菌落生长良好后,用放大镜或低倍镜,观察每格内每个菌落编号并描述,颜色表面边缘切面等,再制片在高倍镜下观察各菌株的个体形态,做好记录。
选择不同菌落分别接于麦芽汁斜面,25℃培养48小时备用。
纯化:
培养基与分离培养基相同,否则,不同培养基菌落会改变形态,决不能认为菌落外观相同菌属于同一种。
菌落外观相近的菌落,只能挑取一至数个菌落为代表进行纯化。
常用方法为平板划线分离法:
挑取单菌落于平板划线纯化菌株,25-28℃2-3d,选择菌生长快菌落大典型继续纯化,每个分离物至少经两次划线,结合镜检保持菌株的纯度,对于保存菌株也应定期检查纯度。
纯化的菌株转接于麦芽汁斜面25-28℃2d待鉴定或用灭菌液体石蜡封面于4℃冰箱保存。
筛选:
性能测定:
根据不同需要,选择不同性能测定方法。
产气性能比较:
采用杜氏管发酵法,将斜面菌种两环接种于麦芽汁或豆芽汁液体培养基中(可以分两次加培养基),28℃振荡培养48h,产气时间和产气量。
产酒精能力测定:
采用蒸馏法测酒精含量。
产香能力测定:
通过嗅觉鉴定。
附:
不同酵母菌的形态特征:
酿酒酵母:
在麦芽汁琼脂培养基上,菌落与细菌相似,比细菌大而厚,不透明,表面光滑,湿润粘稠,乳白色,形成假菌丝。
单细胞,形状有圆形椭圆形等,大小不一。
在麦芽汁中,沉淀表面形成环状膜。
不能利用硝酸盐。
产朊假丝酵母:
在麦芽汁琼脂培养基上菌落为乳白色,平滑,有光泽或无光泽,边缘整齐呈菌丝状。
细胞呈圆形椭圆形和圆柱形等。
能利用硝酸盐为氮源。
实例1:
大曲中酵母菌的分离及鉴定
1.富集培养:
取5g样品,在试管中加入10ml麦芽汁培养基,同时加入一滴乳酸摇匀,25-28℃24h,后取1ml菌液转入另10ml麦芽汁培养基试管中培养25-28℃24h,稍长(过长则霉菌长出)。
培养液变浊产膜或沉淀。
观察:
用无菌操作法取少许菌液置于载玻片中央的0.l%美蓝染色液中,混匀后加盖玻片制成水浸片,先用低倍镜后换高倍镜观察酵母菌的形态和出芽生殖情况。
活酵母菌可使美蓝还原,从而使菌体不着色,用此方法可判断酵母菌的死活。
要求:
较高的糖50g/l,抑菌剂孟加拉红0.03g/L(许多细菌放线菌和快速生长的霉菌),PH4.5。
或用乳酸(5ml)-马铃薯(200g)-葡萄糖(20g)培养基富集。
2.酵母菌分离:
平板划线涂布或混菌均可。
取集菌菌液,梯度稀释,
取10-510-610-7,0.1ml菌液涂布虎红培养基上,25-28℃48h(若
不纯可挑取单菌落连续多次划线)。
3.酵母菌选择:
对典型单菌落,经美兰染色,制片镜检,进行描述性
记录,然后选择不同菌落转接于麦芽汁斜面,25-28℃48h备用。
4.酵母菌纯化:
挑取10-7培养基不同的单菌落,在PDA培养基接种
25-28℃2-3d后,取形态不同的单菌落传接二次,观察菌落形态确
定为单菌落后,分别接种于PDA培养基和MA培养基中,25-28℃3d,
根据在不同培养基中菌落形态进行初步分类。
将所得菌株于斜面培养
保存在4℃冰箱中。
实例2:
高温堆积糟醅中酵母菌的选育
1.集菌:
同上45℃2-3d,依此法转接2-3次,再行分离。
2.分离:
梯度菌液分别涂布于麦芽汁麸皮汁豆芽汁平板于45℃
2-3d,将平皿上生长的菌落划线纯化,菌株移入斜面,备用。
3.有效菌株的确认:
分离的数十株酵母经镜检有酵母属的各种酵母,
假丝酵母,红酵母,白地霉等。
用高粱粉糖化液,饴糖稀释液,麸皮
等进行发酵,测定次生代谢产物,依次判出Y1Y2Y3Y4等与酱香酒
产量质量有关。
4.菌种的分类鉴定:
4.1形态特征:
(麦芽汁琼脂)
编号形态特征
Y1菌落由白色到奶油色,无光泽,软而平滑或部分有皱纹。
边缘呈波纹,凸起,
色黄,中心凹,奶油色,室温放一月后,培养物由奶油色变浅褐色。
细胞呈圆卵
圆椭圆,大小不等。
单个,成双,偶尔成短链,多边芽殖。
(意大利酵母)
Y2菌落呈浅奶油色,菌落平滑或部分有皱纹,无光泽,边缘呈黄色,大波纹状。
细胞圆形卵形椭圆形,大小不等,多边芽殖。
(地生酵母)
Y328℃3d后,细胞圆形椭圆形,单个或成双,两端芽殖,培养物奶油状,奶油色到浅褐色,平滑,稍平坦,光亮,边缘偶尔波纹,无真菌丝。
(酿酒酵母)
Y4菌落白色至奶油色,无光泽,软而平滑或部分有皱纹。
培养时间偏长菌落渐硬,并呈菌丝状,不易挑起。
在麦芽汁平皿上,菌落白色,凸起,有皱纹,边缘波纹状。
细胞较小,卵圆椭圆形,有大量真菌丝。
(间型假丝酵母)
4.2生理生化特征
4.2.1发酵糖类:
酵母菌发酵液成分分析
Y1Y2Y3Y4
香气稍酱香,酯香稍酱香,酯香酯香醇甜香
酒精(%)3.93.94.35.1
代谢产物乙丙丁乳异戊酸同Y1除硫甲基丙醇乙丙丁乳酸
乙醛乙酯乳酯丙醇其他成分均有乙醛丙醇异丁醇
异丁醇异戊醇戊醇异戊醇
硫甲基丙醇
各种酵母发酵糖类结果
葡萄糖++++
D-半乳糖+-+-
麦芽糖+-++
蔗糖+-++
乳糖---+
棉子糖--++
蜜二糖 - - - -
纤维二糖 - - - -
海藻糖 - - + -
松三糖 - - - -
菊糖 - + - +
可溶性淀粉 - + - +
a-甲基-葡萄糖苷 - - - -
同化碳源
乳糖+--+
蜜二糖- - - -
山梨糖 - - - -
松三糖 - - + -
菊糖 - - - -
a-甲基-葡萄糖苷 - - - +
卫茅醇 + - - -
甘露醇 - + - +
D-木糖 - - - -
琥玻酸 + - - +
柠檬酸 + + - +
各酵母菌其他生化生理特征
Y1Y2Y3Y4
同化氮源(硝酸钾)- - - -
同化乙醇 + + - +
液化明胶 - - - +
产酸试验 - - + +
产醋试验 + + + +
结果:
Y1意大利酵母,Y2地生酵母,Y3酿酒酵母,Y4间型假丝酵母
分离耐酸耐高温酵母菌选择压排底醅或双轮底糟为试样,集菌培养基中加入少量底醅浸出液。
当我被上帝造出来时,上帝问我想在人间当一个怎样的人,我不假思索的说,我要做一个伟大的世人皆知的人。
于是,我降临在了人间。
我出生在一个官僚知识分子之家,父亲在朝中做官,精读诗书,母亲知书答礼,温柔体贴,父母给我去了一个好听的名字:
李清照。
小时侯,受父母影响的我饱读诗书,聪明伶俐,在朝中享有“神童”的称号。
小时候的我天真活泼,才思敏捷,小河畔,花丛边撒满了我的诗我的笑,无可置疑,小时侯的我快乐无虑。
“兴尽晚回舟,误入藕花深处。
争渡,争渡,惊起一滩鸥鹭。
”青春的我如同一只小鸟,自由自在,没有约束,少女纯净的心灵常在朝阳小,流水也被自然洗礼,纤细的手指拈一束花,轻抛入水,随波荡漾,发髻上沾着晶莹的露水,双脚任水流轻抚。
身影轻飘而过,留下一阵清风。
可是晚年的我却生活在一片黑暗之中,家庭的衰败,社会的改变,消磨着我那柔弱的心。
我几乎对生活绝望,每天在痛苦中消磨时光,一切都好象是灰暗的。
“寻寻觅觅冷冷清清凄凄惨惨戚戚”这千古叠词句就是我当时心情的写照。
最后,香消玉殒,我在痛苦和哀怨中凄凉的死去。
在天堂里,我又见到了上帝。
上帝问我过的怎么样,我摇摇头又点点头,我的一生有欢乐也有坎坷,有笑声也有泪水,有鼎盛也有衰落。
我始终无法客观的评价我的一生。
我原以为做一个着名的人,一生应该是被欢乐荣誉所包围,可我发现我错了。
于是在下一轮回中,我选择做一个平凡的人。
我来到人间,我是一个平凡的人,我既不着名也不出众,但我拥有一切的幸福:
我有温馨的家,我有可亲可爱的同学和老师,我每天平凡而快乐的活着,这就够了。
天儿蓝蓝风儿轻轻,暖和的春风带着春的气息吹进明亮的教室,我坐在教室的窗前,望着我拥有的一切,我甜甜的笑了。
我拿起手中的笔,不禁想起曾经作诗的李清照,我虽然没有横溢的才华,但我还是拿起手中的笔,用最朴实的语言,写下了一时的感受:
人生并不总是完美的,每个人都会有不如意的地方。
这就需要我们静下心来阅读自己的人生,体会其中无尽的快乐和与众不同。
“富不读书富不久,穷不读书终究穷。
”为什么从古到今都那么看重有学识之人?
那是因为有学识之人可以为社会做出更大的贡献。
那时因为读书能给人带来快乐。
自从看了《丑小鸭》这篇童话之后,我变了,变得开朗起来,变得乐意同别人交往,变得自信了……因为我知道:
即使现在我是只“丑小鸭”,但只要有自信,总有一天我会变成“白天鹅”的,而且会是一只世界上最美丽的“白天鹅”……
我读完了这篇美丽的童话故事,深深被丑小鸭的自信和乐观所折服,并把故事讲给了外婆听,外婆也对童话带给我们的深刻道理而惊讶不已。
还吵着闹着多看几本名着。
于是我给外婆又买了几本名着故事,她起先自己读,读到不认识的字我就告诉她,如果这一面生字较多,我就读给她听整个一面。
渐渐的,自己的语文阅读能力也提高了不少,与此同时我也发现一个人读书的乐趣远不及两个人读的乐趣大,而两个人读书的乐趣远不及全家一起读的乐趣大。
于是,我便发展“业务”带动全家一起读书……现在,每每遇到好书大家也不分男女老少都一拥而上,争先恐后“抢书”,当我说起我最小应该让我的时候,却没有人搭理我。
最后还把书给撕坏了,我生气地哭了,妈妈一边安慰我一边对外婆说:
“孩子小,应该让着点。
”外婆却不服气的说:
“我这一把年纪的了,怎么没人让我呀?
”大家人你一言我一语,谁也不肯相让……读书让我明白了善恶美丑、悲欢离合,读一本好书,犹如同智者谈心、谈理想,教你辨别善恶,教你弘扬正义。
读一本好书,如品一杯香茶,余香缭绕。
读一本好书,能使人心灵得到净化。
书是我的老师,把知识传递给了我;
书是我的伙伴,跟我诉说心里话;
书是一把钥匙,给我敞开了知识的大门;
书更是一艘不会沉的船,引领我航行在人生的长河中。
其实读书的真真乐趣也就在于此处,不是一个人闷头苦读书;
也不是读到好处不与他人分享,独自品位;
更不是一个人如痴如醉地沉浸在书的海洋中不能自拔。
而是懂得与朋友,家人一起分享其中的乐趣。
这才是读书真正之乐趣呢!
这所有的一切,不正是我从书中受到的教益吗?
我阅读,故我美丽;
我思考,故我存在。
我从内心深处真切地感到:
我从读书中受到了教益。
当看见有些同学宁可买玩具亦不肯买书时,我便想到培根所说的话:
“世界上最庸俗的人是不读书的人,最吝啬的人是不买书的人,最可怜的人是与书无缘的人。
”许许多多的作家、伟人都十分喜欢看书,例如毛泽东主席,他半边床上都是书,一读起书来便进入忘我的境界。
书是我生活中的好朋友,是我人生道路上的航标,读书,读好书,是我无怨无悔的追求。
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