黄芪多糖对糖尿病大鼠肾脏水通道蛋白2表达的阻碍及对肾脏的爱惜作用Word文档格式.docx
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APS低剂量组和高剂量组大鼠UAER、Ccr、肾重/体重低于DM组(P&
结论APS下调肾髓质AQP2过度表达,减缓DM水钠潴留,爱惜肾脏。
【关键词】黄芪多糖;
糖尿病;
尿量;
水通道蛋白2
【Abstract】ObjectiveToobservethemechanismofthetherapeuticeffectofastragaluspolysaccharides(APS)againstdiabetesmellitus(DM)ratsbyobservingtheexpressionoftherenalmedullaryaquaporin2andmeasuringthechangeofurinaryvolumein24h.MethodsDMmodelwasmadebyasingleintraperitonealinjectionof55mg/kgstreptozotocin(STZ).30DMratswererandomlydividedintothreegroups:
DM,APSlow,highdosegroups(200,400mg·
kg-1·
d-1APS),andtherewasanothernormalcontrolgroup.Thisstudylasted6weeks.24hurinewascollectedthroughsimplemetaboliccagetomeasureurinaryvolume,theproteinexpressionandlocationofAQP2wereobservedbyimmunofluorescence,kidneymedullaultramicroscopicstructurewasobservedbyTEM.Besides,theratioofrenalweighttobody,urinealbuminexcretionratio(UAER)andcreatinineclearance(Ccr)wasmeasuredrespectively.ResultsDiabeticratsshowedasignificantincreaseinurinaryvolumecomparedwithcontrolrats.APStreatmentcouldobviouslyincreasetheurinaryvolume(P&
.TheexpressionofAQP2wasmarkedlyincreasedinDMversuscontrolgroup,theAPScouldinhibittheexpressionofAQP2.ItshoweddegenerativechangesofkidneyultramicroscopicstructuresoftheDMrats,whileAPStreatmentcouldsignificantlyimprovethedamage.Theratioofrenalweighttobody,UAERandCcrweredecreasedcomparedwiththoseofDMgroup.ConclusionsAPSexertsitstherapeuticeffectsonDMbydecreasingexpressionofAQP2inthekidney.
【Keywords】Astragaluspolysaccharides;
DM;
Urinaryvolume;
AQP2
糖尿病(DM)初期即显现肾脏高血压、高灌注、高滤过等血流动力学异样,对肾脏的损害尤其严峻,常因大量蛋白尿、低蛋白血症显现高度水肿,利尿药长期服用易引发电解质紊乱。
尿液浓缩稀释功能要紧由肾脏集合管主细胞的水通道蛋白2(AQP2)完成。
新近研究报导,DM发生时,大鼠肾脏髓质AQP2表达增加〔1〕,而黄芪多糖(APS)作为医治DM的传统中药黄芪的要紧成份之一,其利尿消肿、改善DM水平稳代谢紊乱的作用是不是与阻碍肾脏髓质AQP2的散布与表达有关,国内外尚未见报导。
因此,本实验给予DM大鼠不同剂量的APS干与,旨在探讨DM时水液代谢异样与AQP2表达改变的关系和APS防治糖尿病肾病(DN)、爱惜肾脏的可能机制,为APS的临床应用与开发提供理论依据。
1材料与方式
实验动物体重(200±
20)g,雄性,健康Wistar大鼠,清洁级,50只,购自山东大学医学院实验动物中心。
实验动物质量合格证号:
SCXK鲁。
试剂药品与仪器链脲佐菌素(STZ,美国Sigma公司),APS(纯度为70%,还有少量黄芪皂甙、氨基酸及黄酮等,西安沃森生物科技),ONETOUCHⅡ血糖仪和试纸(美国强生公司),白蛋白放免试剂盒(中国北京原子能科学研究院)AQP2抗及链霉亲合素生物复合物和异硫氰酸素(SABCFITC)试剂盒、水溶性封片剂等(武汉博士德生物工程),大鼠代谢笼(按徐氏法自行改良制备)。
DM大鼠模型的制备选择空肚血糖正常的健康雄性Wistar大鼠40只,以55mg/kg的剂量一次性腹腔注射STZ,用mol/L柠檬酸柠檬酸钠缓冲液在冰浴中新鲜配制),另10只作为正常对照组,给予腹腔注射同容积的缓冲液。
72h后测定尾静脉血糖,以随机血糖≥mmol/L者确信为糖尿病大鼠。
分组与用药选取造模成功的30只DM大鼠,随机分为DM组、APS高、低剂量组,每组10只。
模型制备成功后第二天,低剂量组给予APS200mg·
d-1,高剂量组给予APS400mg·
d-1。
正常组和DM组各10只,给予等容量的生理盐水,每日上午8~9时腹腔注射,持续用药6w。
检测指标
尿量等的测定第41天给药前30min,给予50ml/kg生理盐水水负荷,30min后,一一挤压大鼠下腹部排尽余尿,各组给药后,当即放入代谢笼,搜集24h尿液,计算尿量后取样用于测定尿白蛋白和肌酐。
因实验进程中有动物死亡,故各组取8只进行检测。
各组大鼠24h尿微量蛋白(UAER)和血肌酐清除率(Ccr)的计算测体重后,美国强生ONETOUCH血糖仪测尾静脉血糖,以10%水合氯醛麻醉大鼠,颈总动脉取血并分离血清,采纳全自动生化分析仪测血肌酐,并计算Ccr,Ccr(ml/min)=尿肌酐浓度×
每分钟尿量/血浆肌酐浓度。
尿蛋白含量采纳放免法测定,尿肌酐采纳苦味酸速度法测定。
UAER(μg/min)=尿蛋白含量(μg/ml)×
24h尿量(ml)/1440(min)。
打开腹腔,活体掏出双侧肾脏,称重。
肾脏AQP2蛋白表达禁食10h,10%水合氯醛麻醉大鼠后,迅速掏出肾脏髓质组织,置入10%多聚甲醛中固定,制备免疫荧光标本,严格按试剂盒说明书操作以检测各组大鼠肾脏AQP2蛋白表达情形。
肾脏超微结构改变10%水合氯醛麻醉大鼠后,迅速掏出肾脏髓质组织,修成1mm×
1mm×
1mm的小块,置于4℃5%的戊二醛前固定,4℃1%锇酸后固定1h。
漂洗后予以乙醇及丙酮脱水,环氧树脂包埋,制成1μm厚的半薄切片,甲苯胺蓝染色后进行组织定位,用钻石刀切制成70nm厚的超薄切片,铀铅染色后以日本H7500型透射电镜观看拍照。
统计学处置应用统计学处置软件,进行单因素方差分析,所有数据均以x±
s表示,组间均数不同的比较采纳q查验。
2结果
APS对DM大鼠尿量的阻碍DM组大鼠尿量明显高于正常组,不同有显著性(P&
;
APS低和高剂量组大鼠尿量均较DM组明显增多(P&
说明APS可明显增加DM大鼠尿量。
见表1。
APS对大鼠肾重/体重、UAER、Ccr的阻碍DM组大鼠肾重/体重、UAER、Ccr明显高于正常组(P&
APS低剂量组和高剂量组三者水平均较DM组明显降低(P&
说明APS可明显改善DM大鼠肾功能。
APS对大鼠AQP2蛋白表达的阻碍免疫荧光结果显示,AQP2要紧在肾脏髓质内集合管管腔内壁细胞表达(黄绿色荧光),着色部位以细胞膜和细胞质为主,肾脏纵剖面上肾小球及细胞外基质及毛细血管均未见表达,与已往报导一致〔2〕。
正常组大鼠肾脏髓质内可见极少部份集合管管腔内壁细胞呈微弱的黄绿色荧光;
DM组大鼠肾脏髓质AQP2的表达较正常组明显增多,可见大部份集合管管腔内壁细胞呈很强的黄绿色荧光;
APS低剂量组和高剂量组大鼠肾脏AQP2的表达较DM组均明显减少,表现为荧光减弱、面积减少。
见图1。
表1黄芪多糖对DM大鼠尿量等的阻碍 图1各组大鼠肾脏髓质AQP2的表达(×
200)
APS对DM大鼠肾脏超微结构的阻碍图2可见,正常组大鼠肾脏远端小管和集合管主细胞超微结构完整,各结构清楚。
细胞核大而圆,染色质分散,基底膜边界清楚,电子密度均匀,基底面质膜内褶整齐,边界清楚,其间可见大量正常线粒体,细胞间有连接复合体,并可见桥粒连接,游离面有大量微绒毛。
DM组细胞核不规那么皱固缩,核周隙局部增宽且核内异染色质有边集现象,基底面质膜内褶显现溶解现象,线粒体肿胀模糊、嵴溶解或消失。
APS低剂量组可见少数细胞核固缩及核周隙增宽,较少细胞核内异染色质有边集现象,部份细胞可见基底面质膜内褶,线粒体较丰硕,嵴部份排列整齐密集,小部份紊乱、消失,嵴间腔扩大,游离面可见大量微绒毛。
APS高剂量组细胞核常染色质多,而异染色质少,线粒体丰硕,线粒体嵴排列整齐密集,个别线粒体嵴间腔增大,基底部质膜内褶清楚可见且排列较整齐,游离面可见大量微绒毛。
图2各组大鼠肾脏电镜观看结果
3讨论
DM初期肾脏肥大、尿白蛋白排出增加、肾小球高滤过是引发晚期肾脏损害的先决条件。
而肾重/体重是衡量肾脏肥大较客观指标之一,UAER是DN初期诊断标准之一,Ccr可间接反映肾小球滤过率的高低。
本实验观看到STZ诱导的DM大鼠血糖明显升高,尿白蛋白排泄明显增多,Ccr和肾重/体重值明显升高,尿量排泄增加,均说明DM模型是成功的。
结果与文献报导相符〔3,4〕,即在糖尿病初期就存在血流动力学紊乱和水盐代谢障碍,存在高滤过、高灌注、尿蛋白增加、肾肥大等肾脏功能和病理的改变。
而致使DM肾脏肥大、尿蛋白排出增加的一个重要机制是肾小球滤过率增加,一样以为高血糖是引发肾小球高灌注、高滤过状态的重要缘故之一。
APS医治后能降低血糖,使Ccr下降,从而改善DM大鼠肾小球高灌注、高滤过状态,进而降低白蛋白的排出和减轻肾脏肥大,说明APS能延缓DN的进展。
电镜观看结果亦进一步证明其肾脏爱惜作用。
研究说明,在DM大鼠中血AVP水平升高〔1〕,这可能与水钠潴留有关,而AVP升高除受非渗透性因素的阻碍外,血浆晶体渗透压的相对升高也是增进下丘脑合成和分泌AVP的因素之一。
DM初期机体处于代偿状态,AVP可代偿性升高,而在晚期那么处于失代偿状态,尽管有重吸收水分的偏向,但尿量仍然增加。
AVP对AQP2的调剂包括短时间调剂和长期调剂,DM大鼠尿量的增加,可能是通过AVP对AQP2的长期调剂,使AQP2mRNA表达增加,促使AQP2合成增加,致使水通透性增加,继而尿量增加。
本研究发觉DM大鼠肾脏髓质AQP2蛋白的表达显著上调,与文献报导相符〔1,5,6〕,APS医治可有效降低肾髓质AQP2的表达,增加水的排出,减缓DM水钠潴留。
提示APS利水消肿具体机制可能为:
在DM中,肾组织中的肾素血管紧张素系统(RAS)兴奋性增高〔7〕,这是引发血AVP浓度升高的途径之一,而APS那么能抑制RAS。
因此推测APS是通过抑制RAS来降低血AVP浓度,从而降低肾脏AQP2的表达,这可能是APS改善DM水盐代谢的机制之一。
本研究结果说明,APS能减缓DM的水钠潴留,爱惜肾功能,有必然的医治作用。
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