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渗漏性缺陷型是特殊的营养缺陷型,由于造成酶活性下降而非完全丧失,属于遗传代谢障碍不完全突变,由于少量合成代谢产物又不会造成反馈抑制,不需要限量添加营养因子。
2、控制细胞膜的透性:
这类突变涉及微生物细胞膜的组成,可对突变株控制外在培养条件,来改变细胞膜的透性从而影响胞内物质的运输和分泌,使胞内代谢产物不会形成高浓度积累解除了反馈调节。
通过细胞膜缺失突变控制透性分为直接影响磷脂的生物合成和间接影响磷脂的生物合成两种。
通过细胞壁的缺失突变控制透性,位于细胞膜外的细胞壁结构,特别是骨架结构如果出现部分破坏或变形会间接影响到膜的通透性。
(2)营养缺陷回复突变:
指突变基因个体再通过突变又成为野生型表型的过程,由于调节酶具有两个独立的亚基结构,与底物结合的催化亚基以及能与效应物结合的调节亚基,若回复突变发生在催化亚基上使催化亚基恢复活性,而调节亚基仍没有活性,可以从根本上解除反馈调节。
(3)结构类似物抗性突变:
变构酶的结构基因或者编码阻遏蛋白的调节基因发生突变,使变构酶或者阻遏蛋白不能与结构类似物结合,此时无论是代谢终产物还是结构类似物对变构酶或阻遏蛋白都丧失了反馈调节作用,从而导致代谢终产物大量合成,从根本上解除了反馈调节。
应注意的是,选育获得结构类似物抗性突变株不一定都是解除了反馈调节的突变株,有些是结构类似物能被代谢解毒或者细胞膜对结构类似物透性异常造成的。
五、自然界获得某一高产菌株的一般步骤
1、调查研究及查阅资料
2、设计实验方案
3、确定采样的生态系统——采集菌种
4、确定增殖培养的条件——增殖培养(产芽孢菌的分离应先进行80℃10min热处理后增殖培养)
5、确定特殊的选择培养基,及可能的定性或定量快速检出法——分离纯化
6、性能鉴定:
初筛;
复筛
加工蜜饯,糖果,蜂蜜土壤中易得到利用糖质原料的耐高渗透压酵母,柠檬酸产生菌,氨基酸产生菌。
食品加工厂,粮食加工场,饭店,日常接触淀粉较多的污水沟的污泥以及水沟旁的土壤易得到以淀粉质原料为碳源的氨基酸产生菌,淀粉酶产生菌。
森林中腐叶烂草下面的土壤,分离得到纤维素酶产生菌。
加工皮革的生皮晒场,蚕丝,豆饼等腐烂变质处土壤分离得到蛋白酶产生菌。
油田,炼油厂的浸油土壤中分离得到降解和利用石蜡,芳香烃,烷烃的微生物。
高渗酵母采用40%葡萄糖的培养基pH2.0~4.0;
产柠檬酸黑曲霉采用90%甘薯粉醪和10%柠檬酸pH2.0~2.5;
分离放线菌采用可溶性淀粉为唯一碳源pH7.0~7.2若加入葡萄糖细菌就会大量繁殖
采样影响因素:
由于光照,水分,通风,养分等原因,一般取离表层5~15CM深处的土壤,秋季温度对微生物生长繁殖最适,避免雨季采集,不同微生物对土壤酸碱度的不同喜好,取样后记录采样时间,地点,环境情况等以备查,并尽快分离防止微生物大量死亡。
增殖培养:
1、控制培养成分——根据各种微生物对营养要求差异控制营养成分达到对目的菌浓缩的效果。
2、控制培养基酸碱度——细菌和放线菌中性或偏碱,酵母菌霉菌一般偏酸,控制pH有利于促进目的菌增殖控制非目的菌繁殖。
3、热处理——根据芽孢和营养细胞对热耐受性差异淘汰不产芽孢的细菌和其他微生物
(80℃10min)
4、增加抑制剂——如增殖放线菌时,加10%酚数滴可抑制霉菌和细菌生长,添加抗生素抑制非目的菌生长。
5、控制培养温度——由于发酵产热要求菌种耐高温,分离时可适当提高培养温度。
纯种分离:
涂布平板法:
样品经无菌生理盐水稀释后用玻璃涂布棒均匀涂布至琼脂培养基表面,表面形成单菌落。
倾注平板法:
将无菌生理盐水稀释后的样品加入无菌培养基混合均匀,待凝固后倒置培养,内部及表面形成单菌落。
平板划线法:
用接种环蘸取少量样品或样品稀释液,在琼脂平板上分区进行划线,培养后得到呈分散状态的单菌落。
细菌酵母菌每平板100~200菌落为佳;
丝状菌控制每平板30~50或更少,可以加0.1%左右去氧胆酸钠或山梨糖防止菌丝蔓延,便于挑取。
组织分离法:
适用于从子实体或罹病植株上分离真菌或植物致病菌,切取小块受病组织,用10%漂白粉水或0.1%升汞进行表面消毒并用无菌水洗涤数次后移置于培养皿中的琼脂培养基表面培养。
平板反应快速检出法:
1、纸片培养显色法:
以饱浸某种指示剂的固体培养基滤纸搁置于培养皿中,用牛津杯架空,下方小团浸有3%甘油的脱脂棉保湿,用接种环将适量细胞悬液接于滤纸上,保湿培养得到分散单菌落,菌落周围形成对应颜色变化,指示剂变色圈与菌落直径之比值大者产物产量高,指示剂可以是酸碱或能与产物反应产生有色物质的其他指示剂。
2、透明圈法:
利用混浊的底物被分解后形成透明圈的大小检出微生物分解利用此物质的能力。
可溶性淀粉常温下不产生混浊,低温环境下溶解度急剧下降产生混浊,培养基中加入可溶性淀粉待单菌落形成后,将平板置于冰箱过夜,形成透明圈。
粉末碳酸钙和酪素检出有机酸或蛋白酶产生菌。
3、变色圈法:
直接用显色剂或指示剂掺入培养基中,根据显色圈或变色圈的形成检出目的菌。
淀粉酶选用稀碘液,刚果红与葡聚糖,羟甲基几丁质结合呈红色。
检出葡聚糖酶,几丁质酶。
4、生长圈法:
根据工具菌在目的菌周围形成的生长圈对目的菌检出的方法。
工具菌一般为某生长因子营养缺陷型,目的菌能在缺乏该生长因子的琼脂培养基上生长并分泌该生长因子或生长后分泌的某种酶能使前体转化成该生长因子,经培养后工具菌就会在目的菌周围形成生长圈。
常用检出氨基酸,核苷酸,维生素产生菌。
5、抑菌圈法:
根据工具菌在目的菌周围生长被抑制形成的抑菌圈对目的菌检出。
目的菌在生长过程中能分泌抗生物质或某种酶将无抑菌作用的前体物质转化为抗生物质而工具菌则为对该抗生物质敏感的菌株,由于微生物生长晚期才能分泌抗生物质故培养时间较长,各菌产生抗生物质会相互干扰,所以要分两步进行,先不加工具菌对样品纯种分离形成菌落后将菌落与周围小块琼脂取出置于另一无菌培养皿保温培养4~5天,使抗生物质在小块琼脂中积累,然后转移到涂有工具菌的鉴定平板保持小块间距2CM,过夜培养后观察抑菌圈,抑菌圈大小反应琼脂块内抗生物质浓度高低,用于抗生素产生菌的检出。
厌氧微生物分离:
培养基中加入还原剂;
加入忍天青等氧化还原指示剂
1、分离琼脂技术:
45℃左右含有还原剂琼脂培养基与待分离样品稀释液混合均匀后加入直径1CM无菌长玻璃管,凝固后两端用橡皮塞封闭,经培养后观察单菌落,用锉刀将玻璃管锯断进行转接,用于白酒发酵窖泥中分离增香微生物乙酸梭菌。
2、厌氧罐技术:
内源性产气袋,产二氧化碳,氢气,钯催化氢气氧气反应。
3、厌氧手套箱技术
筛选:
初筛以量为主(1株1瓶),复筛以质为主(每株3~5瓶),复筛可反复进行多次直至选出1~3个菌株。
六、微生物间相互关系
互生:
两种可单独生活的微生物共存于同一环境时,互为对方提供营养或创造良好生活条件,可分可合,合比分好的互利互惠关系。
例子:
混菌发酵;
好氧性自生固氮菌与纤维素分解菌,后者分解纤维素产生有机酸可为前者提供固氮时营养,前者向后者提供氮素营养物;
二步发酵生产维生素C
共生:
两种生物共局在一起,相互依赖,彼此有利,甚至形成特殊的共生体,它们在生理上表现出一定分工,在组织和形态上产生了新的结构,相依为命的关系。
废水处理甲烷菌(产氢产乙酸菌群)
寄生:
一种微生物生活在另一种微生物的体内或体外,依靠摄取后者细胞的营养生长和繁殖,并使之遭受损害甚至死亡。
损人利己的关系。
噬菌体
噬菌体防治措施:
防重于治;
不用可疑菌种;
严格保持环境卫生;
不排放、丢弃生产菌液;
采用高空优质空气;
加强罐体和管道灭菌;
不断筛选和使用抗噬菌体菌种。
拮抗:
两种微生物生活在一起,其中一种能产生某种特殊的代谢产物或改变环境条件,从而抑制或杀死另一种微生物,排除异己的关系。
青霉素发酵
竞争:
生活在一起的两种微生物,为了生长争夺有限的同一营养或其他共同需要的生长条件而相互竞争,互相受到不利影响,明争暗斗的关系。
发酵工业中杂菌的污染。
七、微生物从环境中吸收营养物质的各种方式(跨膜运输方式)
简单扩散:
指疏水性双分子层细胞膜在无载体蛋白参与下,单纯依靠物理扩散方式,让许多小分子,非电离分子尤其是亲水性分子被动通过的一种物质运送方式。
促进扩散:
溶质在运送过程中,必须借助存在于细胞膜上的底物特异性载体蛋白的协助,但不消耗能量的一类扩散性运送方式。
简单主动运输:
一类须提供能量,并通过细胞膜上特异性载体蛋白构象变化而使膜外环境中低浓度的溶质运入膜内的一种运送方式。
基团移位:
被输送的基质分子在膜内经受了共价的改变,以被修饰的形式进入细胞质的输送机制。
(大肠杆菌运送葡萄糖)
比较项目
简单扩散
促进扩散
简单主动运输
基团移位
特异载体蛋白
无
有
运送速度
慢
快
溶质运送方向
由浓至稀
由稀至浓
平衡时内外浓度
内外相等
内部浓度高得多
运送分子
无特异性
特异性
能量消耗
不需要
需要
运送前后溶质分子
不变
改变
载体饱和效应
与溶质类似物
无竞争性
有竞争性
运送抑制剂
运送对象举例
H2O、CO2、O2、甘油、乙醇、少数氨基酸、盐类、代谢抑制剂
,
、糖(真核生物)
氨基酸、乳糖等糖类、Na+、Ca2+、等无机离子
葡萄糖、果糖、甘露糖、嘌呤、核苷、脂肪酸等
八、温度、氧气、pH、渗透压、表面张力、水活度对微生物的影响,氧对厌氧微生物的毒害机理
温度:
温度通过影响微生物细胞膜的液晶结构,酶和蛋白质的合成和活性、RNA结构及转录等影响微生物生命活动。
一方面随着环境温度上升细胞内生物化学反应速率加快,生长速率逐渐加强直到达到最大生长速率为止,另一方面温度继续上升,细胞中对温度较敏感的组分物质受到不可逆转的破坏生长速率迅速下降。
最低生长温度、最高生长温度、最适生长温度(生长速率最高时的培养温度,对同一微生物来说最适生长温度并非一切生理过程的最适温度)
嗜冷微生物:
最适生长温度为15℃或更低,最高生长温度低于20℃
耐冷微生物:
能在0℃下缓慢生长,最适生长温度20~40℃的微生物
嗜温微生物:
最适生长温度在20~40℃微生物
嗜热微生物:
最适生长温度一般在50~60℃的微生物
极端嗜热微生物:
最适生长温度在80℃以上的微生物
极端温度是指低于微生物的最低生长温度和高于最高生长温度的温度
氧气:
专性好氧微生物:
氧作为最终电子受体,并参与体内甾醇和不饱和脂肪酸的生物合成,具有超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶。
兼性好氧微生物:
在有氧和无氧条件下都能生长但有氧时生长更好,有氧时靠有氧呼吸产能,无氧时则能通过发酵或无氧呼吸产能,而且不需要分子氧参与进行生物合成,具有SOD和过氧化氢酶。
微好氧微生物:
需要氧,以氧作为最终电子受体,但只能在较低氧分压下才能正常生长。
具有SOD和过氧化氢酶。
耐氧厌氧微生物:
可在分子氧存在下进行发酵产能的微生物,它们生长不需要氧,但分子氧对它们无害,具有SOD和过氧化物酶缺乏过氧化氢酶。
专性厌氧微生物:
生长不仅不需要氧,而且分子氧对它们有毒害作用,细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶大多数还缺乏过氧化氢酶。
毒害机理:
生物体内超氧阴离子自由基普遍存在,它是活性氧的形式之一,既有分子氧的性质又有离子性质,其性质极不稳定化学反应力极强,在细胞内可破坏各种重要生物大分子和膜结构还可形成其他活性氧化物,由于专性厌氧微生物缺乏SOD,不能使超氧阴离子自由基歧化成过氧化氢因此分子氧时细胞就受到超氧阴离子自由基的毒害。
pH值:
改变细胞膜所带电荷状态,从而影响细胞对营养物质的吸收;
影响代谢过程中酶的活性;
改变环境中营养物质的可给性;
改变环境中有害物质的毒性
渗透压:
等渗溶液:
微生物正常生长;
低渗溶液:
细胞吸水膨胀,甚至胀破;
高渗溶液:
细胞脱水,影响代谢活动,引起质壁分离,甚至死亡。
表面张力:
低表面张力,微生物在液体中均匀生长。
高表面张力,微生物在液体表面形成菌膜。
改变表面张力的方法:
升高表面张力:
添加无机盐;
降低表面张力:
添加表面活性剂
水活度:
表示环境中微生物可实际利用的自由水或游离水的含量,水是细胞组成成分,还起着溶剂和运输介质的作用,参与细胞内水解、氧化、还原等反应。
辐射:
紫外线能使DNA分子形成嘧啶二聚体,复制时造成局部DNA分子无法配对,从而引起微生物死亡或变异,紫外还可以是空气中的分子氧变成臭氧,臭氧有杀菌作用。
电离辐射,射线间接地通过引起水及其他物质的电离形成自由基,自由基与生物大分子物质反应并使之失活。
作用于氧气分子,产生的强氧化性基团,氧化细胞中的蛋白质和酶分子的巯基,而使细胞受到损伤或死亡。
九、微生物营养物质种类及作用
1、水:
水是细胞组成成分,以水中的H2还原CO2合成糖;
一切营养物或代谢产物的优良溶剂和运输介质;
维持生物大分子的结构稳定性和细胞正常形态;
参与某些生化反应;
为生物生存提供优良环境。
2、碳源:
满足微生物生长繁殖所需碳元素的营养物质,以无机碳源作为主要碳源的微生物为自养微生物,必须利用有机碳源的为异样微生物。
为一切微生物细胞提供有机物的碳架;
为微生物提供能源和H、O来源。
3、氮源:
提供微生物生长繁殖所需氮元素的营养物质,为一切微生物细胞中的含氮有机物提供氮元素;
必要时可作为异样微生物的能源;
少数化能自养微生物可利用NH3等无机氮源作能源。
4、无机盐类:
为微生物生长提供除碳元素以外的各种重要元素,构成酶或菌绿素等的活性中心;
稳定生物大分子活细胞结构;
调节渗透压、pH和氧化—还原电位;
某些化能自养微生物的能源;
细胞内重要分子的成分;
酶的激活剂;
无氧呼吸时的氢受体。
5、生长因子:
调节微生物正常代谢所必需的但不能用简单的碳源氮源自行合成的有机物,作为酶的辅基或辅酶;
提供微生物不能合成的成分。
生长因子自养型微生物:
不需要从外界吸收任何生长因子,多数真菌、放线菌和不少细菌。
生长因子异样型:
需要从外界吸收多种生长因子才能维持正常生长。
6、能源:
为一切微生物的生命活动提供能源。
十、微生物命名法则,举例。
双名法:
学名=
+
大肠杆菌:
Escherichiacoli(Migula)CastellanietChalmers1919
三名法:
酿酒酵母椭圆变种
Saccharomycescerevisiae(var)ellipsoideus
十一、微生物生长曲线各期特点,产生原因,影响因素及应用。
停滞期:
特性:
菌体内物质量显著增长,菌体体积增大或伸长,代谢机能非常活跃,为适应环境可能产生特异的酶,生长速度逐渐加快,对外界理化因素因子抵抗力减弱。
影响:
菌种:
不同菌种停滞期长短不同。
菌龄:
用对数期的菌种接种能缩短停滞期。
接种量:
接种量大小影响停滞期长短,一般接种量大停滞期短。
培养基成分:
接种到营养成分丰富的天然培养基中要比接种到营养单调的组合培养基中的停滞期短,此外培养基成分与微生物生长的培养及成分越接近停滞期越短。
对数期:
经过对新环境的适应阶段后,细胞生长旺盛以几何级数增长。
细胞生长速率最大,酶系活跃代谢旺盛,前期的细胞对理化因素仍较敏感,且菌体大小均匀,单个存在细胞占多数,生理特性较一致,细胞各成分平衡增长生长速率恒定。
不同菌种代时差别大。
营养成分:
同一种微生物在营养丰富的培养基上生长,其代时较短。
营养物浓度:
即可影响微生物生长速率又可影响生长总量。
处于较低浓度范围可影响生长速率和菌体产量的某营养物称为生长限制因子
培养温度:
温度对微生物的生长速率有明显影响。
应用:
增殖噬菌体最适宿主;
代谢、生理等研究的良好材料;
发酵工业中做种子最佳材料。
稳定期:
产生原因:
营养物尤其是生长限制因子的耗尽;
营养物比例失调;
酸醇毒素等有害代谢产物的积累;
pH、氧化还原电势等物理化学条件越来越不适宜。
新增殖的细胞与衰亡细胞数相等;
菌体产量达到最高点;
细胞分裂速率降低;
不少代谢产物特别是次级代谢产物大量合成,大多产芽孢细菌开始产生芽孢。
稳定期积累大量代谢产物是发酵工业产物收获的最佳时期,对维生素、碱基、氨基酸等生物测定的最佳测定时期。
影响因素:
因菌种和培养条件而异
衰亡期:
微生物个体死亡速度超过新生速度,整个群体呈现负增长,细胞形态发生变化,细胞本身所产生的酶和代谢产物作用使菌体分解死亡
取决于微生物本身遗传性能及环境条件。
十二、微生物生长测定方法。
测量生长量
直接法:
称干重:
菌液经离心或过滤后烘干,称重。
量体积:
把菌液倒入刻度离心管中,经离心或自然沉降后计量。
间接法:
比浊法:
细胞悬浮液的浑浊度通常采用波长为600~700nm的分光光度计测定。
(McFarland比浊管法用肉眼比较菌液与不同浓度硫酸钡悬浮液的浑浊度)适用于单细胞微生物,培养基中不含不容物,避免培养基颜色变化对比浊的影响。
生理指标法:
1、测菌液含氮量、含磷量、DNA、RNA、ATP或特殊化学成分。
2、测菌液产酸、产气、产热、耗氧或其黏度等。
计繁殖数:
计总菌数:
借计数板在显微镜下直接计出细菌总数。
计活菌数:
采用美蓝等活菌染料在显微镜下直接计数。
适用于单细胞微生物或单孢子悬液。
平板菌落计数法:
通过浇注或涂布平板法对试样做稀释培养后数出长在平板上的菌落数。
适用单细胞或单孢子菌悬液。
液体试管稀释法:
MPN法,通过试管连续稀释试样,根据培养后的长菌情况查找MPN表后再计算含菌量。
十三、什么是菌种衰退,菌种衰退原因,防治措施,及复壮方法。
菌种的衰退是发生在微生物细胞群中一个由量变到质变的演化过程,主要原因是有关基因的负突变。
开始时,在一个群体中只有个别细胞发生自发突变(一般为负突变)如果这个负突变个体的生长速率大于正常细胞,则随着不断地传代中,群中负突变细胞所占的比例就会逐步增大,最后发展成为优势群,从而使整个群体表现出严重的退化
衰退原因:
主要是有关基因的负突变;
传代次数是加速退化的一个重要原因;
不适宜的培养条件是加速退化的另一重要原因。
防治措施:
1、控制传代次数,尽量避免不必要的移种和传代,将必要的传代降低到最低限度,以减少细胞分裂过程中所产生的自发突变几率。
2、创造良好的培养条件,实践发现创造适合于原种的培养条件,可在一定程度上防止退化。
3、利用不易衰退的细胞传代,在放线菌和霉菌中,由于菌丝体常为多核细胞,甚至是异核体,因此若用菌丝体接种就容易发生分离甚至退化,而孢子一般为单核的,用于接种可保持性状稳定。
4、采用有效的菌种保藏方法,对于工业微生物生产菌种,采用有针对性的保藏方法可延缓退化的发生。
复壮:
狭义复壮指在菌种已经发生退化的情况下通过纯种分离和筛选从已经退化的群体中筛出尚未退化的个体,以达到回复原菌株固有性状的措施。
广义复壮指菌种在典型特征或生产性状尚未退化前,经常有意识地进行纯种分离和筛选,以期从中选择到自发的正突变个体。
复壮方法:
纯种分离,涂布平板、平板划线等;
通过宿主体内生长进行复壮(寄生菌或噬菌体);
淘汰已退化的个体。
十四、溶源性细菌概念及特点
温和噬菌体侵入相应宿主细胞后,由于噬菌体的基因组整合到宿主细胞的基因组上,并随宿主基因组的复制而进行同步复制,并不引起宿主细胞裂解,宿主就称溶源性细菌。
特点:
1、能与温和噬菌体长期共存
2、经自发或诱导后可发生裂解
3、对同种噬菌体有免疫性
4、可进入溶源循环
十五、菌种保藏的方法及适用对象
方法
主要措施
适宜菌种
保藏期
评价
冰箱保藏法(斜面)
低温(4℃)
各大类
约1~6月
简便
冰箱保藏法(半固体)
低温(4℃),避氧
细菌,酵母菌
约6~12月
石蜡油封藏法
低温(4℃),阻氧
各大类(不适用与能同化烃类菌)
约1~2年
砂土保藏法
干燥,无营养
产孢子的微生物
约1~10年
简便有效
甘油悬液保藏法
低温(—70℃),保护剂(15%~50%甘油)
约10年
较简便
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