非典型肺炎SARS实验室培训_精品文档.ppt
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SARS的实验室检测的实验室检测湖南省疾病预防控制中心湖南省疾病预防控制中心张张红红2003年年4月月20日日确定病原的原则确定病原的原则n要从要从病人中分离培养出病原。
病人中分离培养出病原。
n要有血清学的支持证据,即绝大部要有血清学的支持证据,即绝大部分病人的血清应能与所分离的病原分病人的血清应能与所分离的病原反应。
反应。
n将分离病原感染动物,在动物模型将分离病原感染动物,在动物模型上重复出与临床表现类似的特征。
上重复出与临床表现类似的特征。
SARSSARS的病原学研究的病原学研究第一部分:
排除多种传染病第一部分:
排除多种传染病第二部分:
排除禽流感第二部分:
排除禽流感第三部分:
衣原体及相关研究第三部分:
衣原体及相关研究第四部分:
冠状病毒第四部分:
冠状病毒第五部分:
国际研究进展第五部分:
国际研究进展排除多种传染病排除多种传染病l鼠疫鼠疫(plague);plague);l肺炭疽肺炭疽(anthrax);anthrax);l钩端螺旋体钩端螺旋体(leptospiraleptospira););l军团菌军团菌(LegionellaLegionella).).l结核菌(结核菌(tuberclebacillustuberclebacillus,TBTB)l支原体支原体(PPLO)PPLO)排除多种传染病排除多种传染病腺病毒(腺病毒(Adenovirus)Adenovirus),流感病毒流感病毒(Influenzavirus)Influenzavirus),禽流感病毒禽流感病毒(AvineAvineinfluenzavirus)influenzavirus),麻疹病毒麻疹病毒(Mealsvirus)Mealsvirus),副流感病毒副流感病毒(ParainfluenzaParainfluenzavirus)virus),出血热病毒出血热病毒(hemorrhagicfevervirus)hemorrhagicfevervirus);呼吸道合胞病毒呼吸道合胞病毒(respiratoryrespiratorysyncytialsyncytialvirus)virus);肠道病毒(肠道病毒(EnterovirusEnterovirus)排除禽流感排除禽流感对与香港病人有接触及密切接触的对与香港病人有接触及密切接触的7575人,分别采集人,分别采集咽拭子和血清标本进行检测;咽拭子和血清标本进行检测;其中对其中对6767份咽拭子标本接种鸡胚,病毒分离及病原份咽拭子标本接种鸡胚,病毒分离及病原检测均为阴性;检测均为阴性;采用半加敏采用半加敏HIHI法,对法,对7575份血清标本进行甲型流感病份血清标本进行甲型流感病毒毒HH55和和HH99抗体测定,结果均为阴性抗体测定,结果均为阴性(HIHI效价效价1:
51:
5););用用HH55引物进行的引物进行的RTRTPCRPCR扩增,结果为阴性;扩增,结果为阴性;截止目前所有接触及密切接触的截止目前所有接触及密切接触的7575人均未患非典型人均未患非典型肺炎;肺炎;结论:
福建平潭县未见禽流感及非典型肺炎出现。
结论:
福建平潭县未见禽流感及非典型肺炎出现。
流感病毒分离流感病毒分离广东广东162162份病人标本同时接种份病人标本同时接种MDCKMDCK细胞和鸡细胞和鸡胚仅分离到两株乙型流感病毒但未分离到胚仅分离到两株乙型流感病毒但未分离到禽流感病毒(禽流感病毒(Avianinfluenzavirus)Avianinfluenzavirus)。
20022002年年1111月月20032003年年11月,广东地区流感监月,广东地区流感监测点共采集测点共采集529529份标本,分离到份标本,分离到4343株流感病株流感病毒,未见禽流感病毒。
毒,未见禽流感病毒。
全国同期流感监测点共采集全国同期流感监测点共采集32063206份标本,份标本,分离到分离到294294株流感病毒,未见禽流感病毒。
株流感病毒,未见禽流感病毒。
禽流感病毒血清学检测禽流感病毒血清学检测用美国用美国CDCCDC提供的试剂(提供的试剂(19971997年)对中山市年)对中山市77例、广州市例、广州市2020例病人的双份血清及例病人的双份血清及11份病人恢份病人恢复期血清做禽流感病毒(复期血清做禽流感病毒(HH55NN11)血凝抑制实血凝抑制实验,除验,除11例恢复期血清为可疑(滴度例恢复期血清为可疑(滴度11:
2020)其余其余5454份均为阴性(份均为阴性(HIHI效价效价1010)。
此前广东。
此前广东省疾控中心曾对这些标本中的省疾控中心曾对这些标本中的3030份(份(1515对对)血血清标本进行过同样实验清标本进行过同样实验,结果相同。
结果相同。
对另外对另外3636份恢复期血清的份恢复期血清的HH55NN11的血凝抑制实的血凝抑制实验,显示所有标本均为阴性(验,显示所有标本均为阴性(HIHI效价效价1010)。
对对3030份健康人血清标本进行血凝抑制实验,份健康人血清标本进行血凝抑制实验,结果显示所有标本均为阴性(结果显示所有标本均为阴性(HIHI效价效价1010)。
禽流感病毒的分子生物学检测禽流感病毒的分子生物学检测对对33份尸解肺组织标本用份尸解肺组织标本用WHOWHO推荐的禽流感病推荐的禽流感病毒基因(毒基因(MM,NPNP,HH55)特异引物进行特异引物进行RTRTPCRPCR反应,结果均为阴性;反应,结果均为阴性;对对88份存在可疑血凝活性(份存在可疑血凝活性(HAHA)的鸡胚尿囊液的鸡胚尿囊液和和11例咽拭子标本进行例咽拭子标本进行HH55NN11流感病毒全基因组流感病毒全基因组扩增,结果均为阴性。
扩增,结果均为阴性。
对对11例病人含漱液标本进行例病人含漱液标本进行HH55NN11病毒基因扩增,病毒基因扩增,仅仅MM基因为阳性,经与国际基因库(基因为阳性,经与国际基因库(GenBankGenBank)比较,显示为甲型流感病毒序列。
比较,显示为甲型流感病毒序列。
衣原体及相关研究衣原体及相关研究n电子显微镜观察电子显微镜观察n免疫荧光检测免疫荧光检测n病原体组织培养病原体组织培养n组织培养病原体电镜观察组织培养病原体电镜观察n组织培养物的免疫荧光检测组织培养物的免疫荧光检测n药物敏感性研究药物敏感性研究n血清学检测血清学检测电子显微镜观察电子显微镜观察对所收集的来自不同地区、不同医院、死于对所收集的来自不同地区、不同医院、死于非典型肺炎的非典型肺炎的55个病例的标本,电镜观察表个病例的标本,电镜观察表明明55例肺组织肺泡上皮细胞被破坏,肺泡腔例肺组织肺泡上皮细胞被破坏,肺泡腔充满渗出液,胞浆内均可见典型的充满衣原充满渗出液,胞浆内均可见典型的充满衣原体颗粒的包含体,大小不等的原生小体体颗粒的包含体,大小不等的原生小体(EB)EB)和网质小体(和网质小体(RBRB)两种颗粒均可见到,在肺两种颗粒均可见到,在肺毛细血管和肺泡渗出液中也发现有衣原体样毛细血管和肺泡渗出液中也发现有衣原体样颗粒(颗粒(ChlamydiaChlamydia-likeagents)-likeagents)。
在病人的在病人的心、脾、肝、肾和淋巴结等组织中均可见到心、脾、肝、肾和淋巴结等组织中均可见到典型的衣原体样颗粒和包含体。
典型的衣原体样颗粒和包含体。
免疫荧光检测免疫荧光检测n第第四四例例病病人人脾脾脏脏压压片片,用用66份份病病人人血血清清进进行行免免疫疫荧荧光光检检测测,其其中中55份份血血清清在在脾脾脏脏细细胞胞浆浆内内检检测测到到典典型型荧荧光光反反应应,且且荧荧光光有有致致密密灶灶,胞核内未见荧光分布。
胞核内未见荧光分布。
n用用第第五五例例病病人人的的淋淋巴巴结结涂涂片片与与1313份份病病人人血血清清进进行行免免疫疫荧荧光光检检测测,全全部部为为阳阳性性且且荧荧光光也也局局限限在在细细胞胞浆浆内内。
提提示示引引起起本本次次肺肺炎炎的的病病原原体体存在于细胞浆内(病毒存在于细胞浆内(病毒/衣原体)。
衣原体)。
病原体组织培养病原体组织培养n将病人肺组织匀浆液用青、链霉素和红霉素将病人肺组织匀浆液用青、链霉素和红霉素处理后,接种处理后,接种1010种组织培养细胞和鸡胚,观种组织培养细胞和鸡胚,观察细胞病变进行病原体的分离。
察细胞病变进行病原体的分离。
n293293细胞,细胞,HeLaHeLa细胞,细胞,Vero-E6Vero-E6细胞,细胞,22BSBS细胞,细胞,RDaRDa细胞,细胞,HepHep-2-2细胞,细胞,人胚肾细胞,人胚肺细胞,人胚肾细胞,人胚肺细胞,BHKBHK细胞,细胞,MDCKMDCK细胞,鸡胚。
细胞,鸡胚。
n44种组织培养细胞病变种组织培养细胞病变组织培养病原体电镜观察组织培养病原体电镜观察经第经第33次传代的次传代的44种感染细胞进行超薄切种感染细胞进行超薄切片、电镜观察,也发现了典型的衣原体片、电镜观察,也发现了典型的衣原体样颗粒样颗粒(ChlamydiaChlamydia-likeagents)-likeagents)和包含和包含体。
进行电镜检查之前,在染色的半薄体。
进行电镜检查之前,在染色的半薄切片中也可见到大量的衣原体样颗粒及切片中也可见到大量的衣原体样颗粒及包含体。
包含体。
组织培养物的免疫荧光检测组织培养物的免疫荧光检测n用用55份份病病人人血血清清对对组组织织培培养养细细胞胞进进行行免免疫疫荧荧光光检检测测,其其中中22份份确确定定为为阳阳性性,其其它它标标本本荧荧光光较较弱弱,结结果果可可疑疑。
目目前前正正在在进进行行多多份份病病人人急急性性期期/恢恢复复期期血血清清的的免免疫疫荧荧光光检测。
检测。
n用用组组织织培培养养细细胞胞作作为为抗抗原原用用衣衣原原体体抗抗体体(包包括括肺肺炎炎,砂砂眼眼和和鹦鹦鹉鹉衣衣原原体体)进进行行免疫荧光检测,结果为阴性。
免疫荧光检测,结果为阴性。
药物敏感性研究药物敏感性研究能抑制病原生长的抗生素:
能抑制病原生长的抗生素:
阿奇霉素(最小有效浓度:
阿奇霉素(最小有效浓度:
31.2531.25ugug/ml/ml)盐酸四环素(最小有效浓度:
盐酸四环素(最小有效浓度:
1.451.45ugug/ml/ml)左氧氟沙星(最小有效浓度:
左氧氟沙星(最小有效浓度:
5.95.9ugug/ml/ml)多西环素(最小有效浓度:
多西环素(最小有效浓度:
0.150.15ugug/ml/ml)利福平(最小有效浓度:
利福平(最小有效浓度:
375375ugug/ml/ml)红霉素(最小有效浓度:
红霉素(最小有效浓度:
46.8846.88ugug/ml/ml)能抑制病原生长的抗病毒药物:
能抑制病原生长的抗病毒药物:
更昔洛韦(最小有效浓度:
更昔洛韦(最小有效浓度:
23.4423.44ugug/ml/ml)以上结果为以上结果为体外实验结果可供临床医生参考。
体外实验结果可供临床医生参考。
血清学检测血清学检测v建建立立了了使使用用病病人人尸尸体体组组织织抗抗原原和和细细胞胞培培养养抗抗原检测病人血清抗体原检测病人血清抗体IgGIgG和和IgMIgM的的EIAEIA方法。
方法。
v用用上上述述方方法法检检测测病病人人血血清清,发发现现多多数数SARSSARS病病人血清抗体明显阳性:
人血清抗体明显阳性:
使使用用细细胞胞培培养养的的衣衣原原体体样样抗抗原原,检检测测出出的的抗抗体体成成份份主主要要为为IgMIgM,88个个SARSSARS病病人人IgMIgM检检测测全全部部阳阳性性,滴滴度度在在11:
20020011:
16001600之之间间;3030个个SARSSARS病病人人中中2626人人IgGIgG抗抗体体阳阳性性,但但滴滴度度偏偏低低,1010的的为为强强阳阳性性;3030个个普普通发烧病人对照均为阴性。
通发烧病人对照均为阴性。
使使用用病病人人肺肺组组织织内内衣衣原原体体样样抗抗原原(方方法法同同上上)检检测测结果与细胞培养抗原的检测结果高度一致
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