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第十九章第十九章遗传代谢性疾病遗传代谢性疾病的基因诊断的基因诊断第三军医大学第三军医大学第三军医大学第三军医大学府伟灵府伟灵府伟灵府伟灵黄庆黄庆黄庆黄庆退出退出卫生部卫生部“十一五十一五”规划教材规划教材全国高等医药教材建设研究会规划教材全国高等医药教材建设研究会规划教材主要内容主要内容前言前言一、基因诊断技术一、基因诊断技术二、遗传代谢性疾病的基因诊断二、遗传代谢性疾病的基因诊断l细胞、组织、器官和机体的生存与功能维持都必须细胞、组织、器官和机体的生存与功能维持都必须依赖不断进行的物质代谢过程。
依赖不断进行的物质代谢过程。
l物质代谢包括合成代谢及分解代谢两个过程。
物质代谢包括合成代谢及分解代谢两个过程。
l代谢性疾病是物质代谢过程的紊乱,多为酶或蛋白代谢性疾病是物质代谢过程的紊乱,多为酶或蛋白异常所致。
异常所致。
l根据代谢性疾病的病因,可将其分为原发性和继发根据代谢性疾病的病因,可将其分为原发性和继发性。
性。
前前言言返回章返回章二、代谢性疾病的诊断手段二、代谢性疾病的诊断手段二、代谢性疾病的诊断手段二、代谢性疾病的诊断手段二、代谢性疾病的诊断手段二、代谢性疾病的诊断手段一、代谢性疾病的分类一、代谢性疾病的分类一、代谢性疾病的分类一、代谢性疾病的分类一、代谢性疾病的分类一、代谢性疾病的分类一、代谢性疾病的分类一、代谢性疾病的分类原发性代谢性疾病:
原发性代谢性疾病:
又叫先天性代谢性疾病。
是指当编码物质代谢所又叫先天性代谢性疾病。
是指当编码物质代谢所需酶或蛋白的基因发生突变、不能合成或合成了无活需酶或蛋白的基因发生突变、不能合成或合成了无活性的产物时,就会导致有关代谢途径不能正常运转,性的产物时,就会导致有关代谢途径不能正常运转,造成具有不同临床表型的各种代谢缺陷病。
造成具有不同临床表型的各种代谢缺陷病。
继发性代谢性疾病:
继发性代谢性疾病:
继发性代谢性疾病是由其它原发性疾病导致的代继发性代谢性疾病是由其它原发性疾病导致的代谢性疾病,如糖尿病导致的继发性高脂血症。
谢性疾病,如糖尿病导致的继发性高脂血症。
返回节返回节二、代谢性疾病的诊断手段二、代谢性疾病的诊断手段二、代谢性疾病的诊断手段二、代谢性疾病的诊断手段l过去:
过去:
主要依靠与物质代谢相关的各种酶的主要依靠与物质代谢相关的各种酶的生物化学方面的诊断生物化学方面的诊断l现在:
现在:
生化诊断生化诊断+基因诊断基因诊断返回节返回节基因诊断的概念基因诊断的概念基因诊断的概念基因诊断的概念基因诊断就是利用现代基因诊断就是利用现代分子生物学和分子遗传学的分子生物学和分子遗传学的技术方法技术方法,直接检测基因结构直接检测基因结构及其表达水平是否正常及其表达水平是否正常,从而从而对疾病作出诊断的方法。
对疾病作出诊断的方法。
返回节返回节基因诊断的特点基因诊断的特点基因诊断的特点基因诊断的特点l针对性强针对性强l特异性高特异性高l灵敏度高灵敏度高l适用性强适用性强l诊断范围广诊断范围广返回节返回节第一节第一节基因诊断技术基因诊断技术二二二二.聚合酶链反应技术聚合酶链反应技术聚合酶链反应技术聚合酶链反应技术三三三三.毛细管电泳技术毛细管电泳技术毛细管电泳技术毛细管电泳技术四四四四.基因芯片技术基因芯片技术基因芯片技术基因芯片技术一一一一.DNA.DNA.DNA.DNA测序技术测序技术测序技术测序技术返回章返回章一、一、一、一、DNADNADNADNA测序技术测序技术测序技术测序技术所有生物基因组序列的数所有生物基因组序列的数据均来自据均来自DNADNA测序测序特点特点:
l稳定简便稳定简便l自动化程度高自动化程度高l数据准确可靠数据准确可靠l公认为国际金标准公认为国际金标准返回节返回节双脱氧链终止法双脱氧链终止法双脱氧链终止法双脱氧链终止法原理原理:
l测序基础是以测序基础是以ddNTPddNTP为为测序反应的链终止剂测序反应的链终止剂l掺入到延伸链中的掺入到延伸链中的ddNTPddNTP可阻止后续可阻止后续ddNTPddNTP或或dNTPdNTP的掺入的掺入返回节返回节返回节返回节示例:
示例:
BigDyeTerminatorsBigDyeTerminatorsl循环测序反应扩增到未端为循环测序反应扩增到未端为BigDyeBigDyeTerminatorsTerminators的的一系列的核苷酸链。
一系列的核苷酸链。
l循环测序反应产物经沉淀、洗涤和纯化,从而去除多循环测序反应产物经沉淀、洗涤和纯化,从而去除多余的未反应的余的未反应的BigDyeBigDyeTerminatorsTerminators。
l电泳与结果分析。
电泳与结果分析。
返回节返回节返回节返回节焦磷酸测序技术焦磷酸测序技术焦磷酸测序技术焦磷酸测序技术原理原理:
引物与模板引物与模板DNADNA退火后,在退火后,在DNADNA聚合酶、聚合酶、ATPATP硫硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶等酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶等44种酶种酶的协同作用下,将每一个的协同作用下,将每一个dNTPdNTP的聚合与一次荧光信的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来,通过检测荧光的释放和强度,号的释放偶联起来,通过检测荧光的释放和强度,以荧光信号的形式实时记录模板以荧光信号的形式实时记录模板DNADNA的核苷酸序列。
的核苷酸序列。
返回节返回节返回节返回节ABDNAPolymeraseACCTTGAATTCGTCCTAGGAGGATCTTdNTPApyrase(d)NMPPPiATPATP-sulphurylaseLuciferaseLightCTGCTTAAAGTCAGTCAGTCAGTC基本流程:
基本流程:
第第11步步一个特异性的测序引物和单链一个特异性的测序引物和单链DNADNA模板结合,然后加入酶模板结合,然后加入酶混合物混合物(包括包括DNAPolymeraseDNAPolymerase、ATPATPSulfurylaseSulfurylase、LuciferaseLuciferase和三磷酸腺苷双磷酸酶和三磷酸腺苷双磷酸酶ApyraseApyrase)和底物混合和底物混合物物(包括腺苷酰硫酸包括腺苷酰硫酸APSAPS和和LuciferinLuciferin)。
返回节返回节基本流程:
基本流程:
第第22步步向反应体系中加入向反应体系中加入11种种dNTPdNTP,如果它刚好能和,如果它刚好能和DNADNA模板的模板的下一个碱基配对,则会在下一个碱基配对,则会在DNADNA聚合酶的作用下,添加到聚合酶的作用下,添加到测序引物的测序引物的33末端,同时释放出一个分子的焦磷酸末端,同时释放出一个分子的焦磷酸(PPiPPi)。
返回节返回节(DNA)n+dNTP(DNA)n+1+PPi聚合酶聚合酶基本流程:
基本流程:
第第33步步在在ATPATP硫酸化酶的作用下,生成的硫酸化酶的作用下,生成的PPiPPi可以和可以和APSAPS结合形成结合形成ATPATP;在荧光素酶的催化下,生成的;在荧光素酶的催化下,生成的ATPATP又可以和荧光素又可以和荧光素结合形成氧化荧光素,同时产生可见光。
通过结合形成氧化荧光素,同时产生可见光。
通过CCDCCD光学系光学系统即可获得一个特异的检测峰,峰值高低则和相匹配的统即可获得一个特异的检测峰,峰值高低则和相匹配的碱基数成正比。
碱基数成正比。
返回节返回节基本流程:
基本流程:
第第44步步反应体系中剩余的反应体系中剩余的dNTPdNTP和残留的少量和残留的少量ATPATP在在ApyraseApyrase的作的作用下发生降解。
用下发生降解。
返回节返回节dNTPdNDP+dNMP+PiATPADP+AMP+PiATPATP双磷酸酶双磷酸酶ATPATP双磷酸酶双磷酸酶基本流程:
基本流程:
第第55步步加入另一种加入另一种dNTPdNTP,使,使第第2244步反应重复进步反应重复进行,根据获得的峰值行,根据获得的峰值图即可读取准确的图即可读取准确的DNADNA序列信息序列信息返回节返回节DNA序列GGCC-TAAGGGCCCTT核苷酸递增返回节返回节焦磷酸盐测序法步骤焦磷酸盐测序法步骤二、聚合酶链反应技术二、聚合酶链反应技术二、聚合酶链反应技术二、聚合酶链反应技术PCRPCR是体外酶促合成特异是体外酶促合成特异DNADNA片段的方法。
片段的方法。
l四种主要成分:
四种主要成分:
DNADNA模板、引物、模板、引物、DNADNA聚合酶和聚合酶和dNTPdNTP。
l三个反复步骤:
三个反复步骤:
高温变性、低温退火和高温变性、低温退火和适温延伸。
适温延伸。
返回节返回节三、毛细管电泳技术三、毛细管电泳技术三、毛细管电泳技术三、毛细管电泳技术l毛细管电泳毛细管电泳统指以高压电场为驱动力,以统指以高压电场为驱动力,以毛细管为分离通道,依据试样中各组分毛细管为分离通道,依据试样中各组分间淌度和分配行为上的差异来实现分离间淌度和分配行为上的差异来实现分离的一类的一类分离技术。
分离技术。
l基本原理是根据在电场作用下离子迁移的基本原理是根据在电场作用下离子迁移的速度不同而对组分进行分离速度不同而对组分进行分离和分析。
和分析。
返回节返回节返回节返回节变性高效液相色谱变性高效液相色谱(DHPLC)是一种新的是一种新的高通量筛选高通量筛选DNA序列变异的技术,其原序列变异的技术,其原理是利用离子对反向高效液相色谱原理理是利用离子对反向高效液相色谱原理,通过一个通过一个DNA分离柱,进行核苷酸片段分离柱,进行核苷酸片段的分离和分析。
的分离和分析。
四、四、四、四、基因基因基因基因芯片技术芯片技术芯片技术芯片技术基因芯片技术基因芯片技术就是指将大量特定的靶基因片段就是指将大量特定的靶基因片段或寡核苷酸片段作为探针有序和高密度地排列固或寡核苷酸片段作为探针有序和高密度地排列固定于玻璃和硅等固相载体上,然后检测与待测的定于玻璃和硅等固相载体上,然后检测与待测的不同荧光标记样品基因按碱基配对的原理进行杂不同荧光标记样品基因按碱基配对的原理进行杂交,通过激光共聚焦系统检测探针分子的杂交信交,通过激光共聚焦系统检测探针分子的杂交信号强度,经计算机分析处理数据资料,获取不同号强度,经计算机分析处理数据资料,获取不同样品分子的数量和大量生物信息,从而可对基因样品分子的数量和大量生物信息,从而可对基因序列及功能进行大规模和高通量的研究。
序列及功能进行大规模和高通量的研究。
返回节返回节第二节第二节遗传代谢性疾病的基因诊断遗传代谢性疾病的基因诊断遗传代谢性疾病是指由于基因突变导致酶的质和量的遗传代谢性疾病是指由于基因突变导致酶的质和量的改变,从而所催化的酶促反应发生变化而引起的一系列疾改变,从而所催化的酶促反应发生变化而引起的一系列疾病。
病。
一、一、一、一、一、一、代谢性疾病代谢性疾病代谢性疾病代谢性疾病代谢性疾病代谢性疾病的特征及基因诊断策略的特征及基因诊断策略的特征及基因诊断策略的特征及基因诊断策略的特征及基因诊断策略的特征及基因诊断策略二、苯丙酮酸尿症(二、苯丙酮酸尿症(二、苯丙酮酸尿症(二、苯丙酮酸尿症(二、苯丙酮酸尿症(二、苯丙酮酸尿症(PKU)PKU)PKU)PKU)PKU)PKU)三、三、三、三、三、三、同型胱氨酸尿症同型胱氨酸尿症同型胱氨酸尿症同型胱氨酸尿症同型胱氨酸尿症同型胱氨酸尿症(HCU)(HCU)(HCU)(HCU)(HCU)(HCU)四、四、四、四、四、四、酪氨酸血症酪氨酸血症酪氨酸血症酪氨酸血症酪氨酸血症酪氨酸血症五、五、五、五、五、五、半乳糖血症半乳糖血症半乳糖血症半乳糖血症半乳糖血症半乳糖血症六、六、六、六、六、六、糖原累积症糖原累积症糖原累积症糖原累积症糖原累积症糖原累积症七、七、七、七、七、七、果糖不耐症果糖不耐症果糖不耐症果糖不耐症果糖不耐症果糖不耐症八、八、八、八、八、八、家族性高脂蛋白血症家族性高脂蛋白血症家族性
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