诺如病毒标本处理和实验室检测技术方案_精品文档.ppt

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2015年版诺如病毒标本处理和实验室检测技术方案目录前言0标本前处理1核酸提取2诺如病毒核酸检测方法3诺如病毒ELISA检测方法（粪便、呕吐物）4前言诺如病毒完整的检测及分型流程包括标本前处标本前处标本前处标本前处理、理、理、理、RNARNA提取、提取、提取、提取、Real-timeRT-PCRReal-timeRT-PCR检测、传统检测、传统检测、传统检测、传统RT-PCRRT-PCR检测、测序和基因分型检测、测序和基因分型检测、测序和基因分型检测、测序和基因分型6个步骤。

Real-timeRT-PCR方法灵敏度和准确度高，是检测诺如病毒的金标准。

用传统RT-PCR可对Real-timeRT-PCR阳性标本的PCR产物进行测序，通过序列分析确定诺如病毒的基因群和基因型。

在发生聚集或暴发时，ELISA方法可作为辅助的手段快速检测诺如病毒抗原。

食品、水、环境涂抹样检测方法的灵敏度不稳定，仅作为参考方法。

1标本前处理1.1粪便、呕吐物1.3环境涂抹样1.2水1.4.1贝类1.4.2三文鱼1.4.3草莓、蓝莓1.4.4生菜和苗芽菜1.4食品1标本前处理1.1粪便、呕吐物1.1.1设备和材料微量移液器、无菌过滤器、漩涡振荡器、微量离心机、1.5ml无菌离心管、磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）10mMpH7.0-7.4。

1.1.2操作方法

（1）离心管每管分装0.5mlPBS。

用一次性移液管（或无菌棒）添加豌豆大小的粪便（约0.1克），稀释成约10至20（重量/体积）的粪便悬浮液。

当粪便样品是液态时，不必在PBS中稀释，直接使用500ul的样品。

（2）漩涡振荡每个样品1分钟。

在5000rpm下1标本前处理离心5分钟，使得固体沉淀。

澄清上清液可以直接用于病毒核酸提取或贮存于-70。

（3）取澄清的上清液200ul进行RNA提取。

1标本前处理1.2水通过阴离子滤膜过滤水样品。

用牛肉膏（1.5%w/v）含0.05M甘氨酸（pH9.0）缓冲液洗脱附在膜上的病毒。

使用Microsep100TM或CentriconTMcolumns离心管进一步浓缩洗脱液。

1.2.1设备和材料DEPC水、新配制次氯酸盐（至少1%）或等效消毒剂、MilliporeHAfilter（孔径0.45um、）、换膜过滤器、真空泵、计时器、PH值酸度计、磁力搅拌器及转子、低温冰箱（-20、-70）、Microsep100Kcolumns（PALL公司）、CentriprepYM-50（Millipore公司）、洗脱液（BE-0.05GlypH7.0）、PBS（pH7.2）、离心机、DEPCDEPC水是用水是用DEPC（diethylpyrocarbonateDEPC（diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯，焦碳酸二乙酯）处理过并经高温高压处理过并经高温高压灭菌的灭菌的MiliQMiliQ纯水，无色液体。

经检测不含杂质纯水，无色液体。

经检测不含杂质RNARNA、DNADNA和蛋白质。

和蛋白质。

1标本前处理氯仿、丁醇。

1.2.2操作方法1.2.2.1过滤装置准备

（1）使用无菌的镊子将滤膜放在滤器架上，滤膜有三层，型号分别为MilliporeHAfilter、AP15和AP20，放置顺序为MilliporeHAfilterAP15AP20。

注意：

暴露出滤膜表面使其能与水样接触，请将滤膜光滑表面的那边向下。

所有的玻璃器皿应干净无菌。

每批水样使用不同的漏斗。

1标本前处理

（2）将滤膜置中，将有刻度的漏斗放在滤器的上边。

（3）使用不锈钢滤器夹进行水的密封。

（4）真空泵连接1000ml的锥形瓶。

注意：

为防止气溶胶的污染，应在无菌的环境中过滤，在生物安全柜进行操作。

（5）向滤器中倒入20ml无菌水（DEPC水）检查滤膜的密封情况。

（6）打开泵，调整水的流速至形成缓慢的细流。

1标本前处理1.2.2.2水样品的过滤

（1）向玻璃漏斗里倒水样，当水样完全滤过立刻关闭真空泵。

（2）用不锈钢的滤器夹，小心移开滤膜上的刻度漏斗。

1.2.2.3用酸漂洗滤膜将膜用无菌的镊子夹放在有200ml0.05mMH2SO4（pH3.0）的无菌500ml烧杯中进行漂洗滤膜去除Mg2+。

1.2.2.4洗脱

（1）将膜夹出放在无菌的60mm培养皿中，加5ml洗脱液。

盖上铝箔。

1标本前处理注意：

要将滤膜的上边向下（倒置）放在锥形瓶里。

（2）将锥形瓶放在恒温摇床上，转速45rpm，室温（233），15min。

（3）关闭摇床，将洗脱液（大约5ml）转移到管子里。

1.2.2.5中和洗脱液用1NHCl或1NNaOH调整洗脱液的pH到7.0-7.4。

检测前，洗脱液在-70储藏。

1.2.2.6二次浓缩1标本前处理方法一：

用Microsep100Kcolumns或CentriprepYM-50浓缩病毒

（1）为防止病毒的附着，先用无病毒粒子的洗脱液浸湿过滤器。

（2）将水标本滤膜洗脱液（大约5ml）加入到浓缩柱中，5000rpm离心5min。

（3）吸取浓缩液（约150l），转移至1.5ml离心管中。

1标本前处理方法二：

PEG沉淀

（1）向标本洗脱液中加入NaCl终浓度是0.3mol/L（若洗脱液为5ml加0.08775g的NaCl）,有助于病毒的沉淀，再等量加入PEG-6000终浓度为12.5（w/v）（若洗脱液为5ml，加0.0625g的PEG-6000。

4过夜。

（2）4，10000rpm离心30分钟，收集沉淀。

（3）MilliporeHAfilter，倾倒并弃掉上清液。

每个离心管添加150-500lpH7.2（0.2）PBS重悬沉淀物。

将离心管放置在离心管架上，为更好的让缓冲液与沉淀物接触，将离心管架成一定角度放置。

室温放置30min。

1标本前处理注意：

如果沉淀物没有溶解，可用缓冲液反复的轻轻吹打沉淀物。

吹打过力会产生气泡。

（4）向悬液中加入等体积的氯仿/丁醇（1:

1vol/vol）混合。

去除病毒悬液中的抑制剂。

（5）4，10000rpm，离心20分钟。

（6）分离出水相（上清液），-80储藏。

（7）取200l上清液进行核酸提取。

1标本前处理1.3环境涂抹样将棉签在PBS里蘸湿，用力涂抹待测表面（最大面积100cm2）后，立即浸入核酸提取试剂盒裂解缓冲液中（QIAamp试剂盒560l，Genaid试剂盒400l），将棉签用力压EP管的侧壁，释放棉签中的液体。

重复浸入和压侧壁的步骤3-4次，确保病毒最大释放量，直接进入核酸提取步骤。

1标本前处理1.4.3草莓、蓝莓1.4.2三文鱼1.4.1贝类1.4食品1.4.4生菜和苗芽菜1标本前处理1.4食品1.4.1贝类贝类1.4.1.1设备和材料诺如病毒质控样（中国食品药品检定研究院）、高速离心机（可离心15mL50mL体积）、台式离心机、碎花制冰机、生物安全柜、实时荧光定量PCR检测系统、眼科剪、眼科镊、一次性无菌培养皿、恒温摇床、高压灭菌器、电磨均质器（LX134MO）、一次性研磨杵（上海生工）、15mL去RNAase离心管、1.5mL去RNAaseEppendorf管、20L、200L、1000L微量移液器、PBS溶液pH7.2（Gebico）、蛋白酶K（PCR级Roche）。

1标本前处理1.4.1.2贝类样品处理程序样品采集贝类的解剖及消化腺肠道的剪取消化腺和肠道组织的均质RNA提取1标本前处理1.4.1.3解剖方法5个贝类个体作为一件样品，分别解剖，取其消化腺和肠道，用于检测。

如果一件样品的消化腺和肠道的总质量不够2.0g，应适当增加取样量，使得每件样品检验的总质量达到2.0g。

（1）牡蛎的解剖方法使用灭菌的刀具将牡蛎壳撬开，使用灭菌的眼科剪和眼科镊，先将牡蛎的内脏部分剪取下来放到一个灭菌的平皿里，沿肠道将牡蛎软体部分剪开，暴露出肠道和消化腺，将多余的组织去掉，取其消化腺和肠道用于检测。

牡蛎的解刨过程及解剖结构见下图。

1标本前处理1标本前处理

（2）海虹用灭菌刀具将双壳撬开，将消化腺用镊子直接夹下，同时尽量将肠道取下。

由于海虹的消化腺相对牡蛎较小，所以需要增加取样的海虹个体数，以使得总质量达到2.0g，用于后续的检测。

海虹的解剖结构见下图，图中镊子所指的位置为海虹的消化腺。

1标本前处理（3）扇贝、毛蚶与文蛤扇贝与毛蚶的解剖结构与海虹相似，参照海虹的方法将壳打开后，直接判断消化腺所处的位置，用眼科镊和眼科剪，将其消化腺和肠道取下用于诺如病毒的检测。

文蛤的消化腺包在内脏团里，在解剖时可以直接用镊子在内脏团消化腺位置撕开，将消化腺取下，同时将肠道取出，用于检测，文蛤的消化腺体积较小，需要适当增加取样量以满足检验的要求。

1.4.1.4均质将上述解剖下的消化腺和肠道放到50mL灭菌的小烧杯内，用电磨均质器（LX134MO）将消化腺仔细打碎，成糊状。

1标本前处理1.4.1.5蛋白酶K消化将上述均质的消化腺，分别称取2.00.1g，加入15mL的离心管，然后每管加入2mL的PBS溶液，加入20mg/mL蛋白酶K（Roche）溶液10L进行消化，另外取1件样品加入诺如病毒的阳性质控球，作为外部质控阳性对照。

1.4.1.6将上述样品于摇床37，320rpm振荡1h。

恒温水浴60，保持15min；将15mL离心管，3000g离心5min，取200L用于RNA的提取，剩余部分冷冻保存，用于复检。

1标本前处理1.4.2三文鱼1.4.2.1设备和材料诺如病毒质控样（中国食品药品检定研究院）、恒温振荡器、食品均值器、天平：

感量0.1g、高速低温离心机（4，10000g）、5PEG8000/NaCl溶液（PEG80005002g，NaCl871g,先用450mL蒸馏水溶解，稍微加热，待溶解后定容至1000mL，121，15min灭菌）、磷酸盐缓冲液（PBSpH7.2）、Tris/甘氨酸/牛肉膏缓冲液（TGBE）（Trisbase12.10.2g,甘氨酸3.80.1g，牛肉膏101.0g，蒸馏水10001mL，121，15min灭菌）、氯仿/正丁醇（1:

1体积比）溶液。

1标本前处理1.4.2.2样品处理程序及方法1标本前处理

（1）取三文鱼样品25g，剪碎后置于带滤网的均质袋中，加人TGBE缓冲液40mL，均质均匀，于室温60r/min震荡20min。

（2）取滤液至50mL新的离心管中，4，10000g离心30min。

（3）取上清液（小心避开液体表面的油脂层），加入上清液1/4体积的5PEG/NaCl溶液，颠倒60s，4，60r/min震荡60min。

（4）将上述溶液于4，10000g离心30min，弃去上清液。

向沉淀物中加入PBS溶液700L，震荡重悬。

1标本前处理（5）加入与上述重悬液等体积的氯仿/正丁醇（1:

1）溶液，充分振荡，室温孵育5min。

于4，10000g离心15min。

（6）取上层水相液体200L用于提取病毒RNA。

1标本前处理1.4.3草莓、蓝莓1.4.3.1设备和材料诺如病毒质控样（中国食品药品检定研究院）、PEG8000（Polyethyleneglycol）、氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）、碳酸氢钠（NaHCO3）、磷酸二氢钾（KH2PO3）、磷酸氢二钠（Na2HPO3）、NaOH溶液（5M）、HCl溶液（1M）、纯水（MilliQ系统净化）、氯仿（Methenyltrichoride）、丁醇（1-Butanol）、牛肉膏（BeefExtract）、甘氨酸（Glycine）、蛋白酶K（ProteinaseK）、果胶酶（PectinasefromAspergilusniger，Sigma）、5PEG/NaCl缓冲液（PEG80005002g，NaCl871g,1标