第八章 发酵工艺控制Word格式文档下载.docx
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由于没有物料取出,产物的积累最终导致
比生产速率的下降;
由于有物料的加入增
加了染菌机会。
三)半连续发酵
•在补料-分批发酵的基础上间歇放掉部分发酵液(带放)称为半连续培养。
带放是指放掉的发酵液和其他正常放罐的发酵液一起送去提炼工段。
某些品种采取这种方式,如四环素发酵。
优点:
放掉部分发酵液,再补入部分料液,使代谢
有害物得以稀释有利于产物合成,提高了总
产量。
缺点:
1)放掉发酵液的同时也丢失了未利用的养分
和处于生产旺盛期的菌体;
2)定期补充和带放使发酵液稀释,送去提炼
的发酵液体积更大;
3)发酵液被稀释后可能产生更多的代谢有害
物,最终限制发酵产物的合成;
4)一些经代谢产生的前体可能丢失;
5)有利于非产生菌突变株的生长。
四)连续发酵
•发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液,使发酵罐内的体积维持恒定。
•达到稳态后,整个过程中菌的浓度、产物浓度、限制性基质浓度都是恒定的。
优点控制稀释速率D可以使发酵过程最优化;
发酵周期长,得到高的产量;
由于比生长速率μ=D,通过改变稀释速率可以比较容易研究菌生长的动力学。
缺点如果菌种不稳定,长期连续培养会引起菌种退化,降低产量;
长时间补料染菌机会大大增加。
二、发酵条件的影响及其控制
•常规的发酵条件有:
罐温、搅拌转速、空气流量、罐压、液位、补料、加糖、油或前体、通氨速率以及补水(需要的话)等的设定和控制。
•能表征过程性质的状参数有:
pH、溶氧(DO)、溶解CO2、氧化还原电位(rH),尾气O2和CO2含量、基质(如葡萄糖)或产物浓度、代谢中间体或前体浓度、菌浓(以OD值或细胞干重DCW等代表)等。
通过直接状态参数还可以求得各种更有用的间接状态参数。
•微生物发酵的生产水平取决于生产菌种的特性和发酵条件(包括培养基的控制)。
一)溶氧的影响
溶氧(DO)是需氧微生物生长所必需。
在发酵过程中有多方面的限制因素,而溶氧往往是最易成为控制因素。
在28℃氧在发酵液中的100%的空气饱和浓度只有7mg.L-1左右,比糖的溶解度小7000倍。
在对数生长期即使发酵液中的溶氧能达到100%空气饱和度,若此时中止供氧,发酵液中溶氧可在几分钟之内便耗竭,使溶氧成为限制因素。
(一)微生物对氧的需求
1、描述微生物需氧的物理量
比耗氧速度或呼吸强度(QO2):
单位时间内单位体积重量的细胞所消耗的氧气,mmolO2·
g菌-1·
h-1
摄氧率(r):
单位时间内单位体积的发酵液所需要的氧量。
mmolO2·
L-1·
h-1。
r=QO2.X
2、溶解氧浓度对菌体生长和产物形成的影响
CCr:
临界溶氧浓度,指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。
一般对于微生物:
CCr=1~25%饱和浓度
例:
酵母4.6×
10-3mmol.L-1,1.8%
产黄青霉2.2×
10-2mmol.L-1,8.8%
问题:
一般微生物的临界溶氧浓度很小,是不是发酵过程中氧很容易满足。
注意:
由于产物的形成和菌体最适的生长条件常常不一样:
头孢菌素卷须霉素
生长5%(相对于饱和浓度)13%
产物>
13%>
8%
3、影响需氧的因素
菌体浓度
(二)反应器中氧的传递
1、发酵液中氧的传递方程
N=kg(p–pi)=kL(ci–cL)
N:
传氧速率kmol/m2.h
kg:
气膜传质系数kmol/m2.h.atm
kL:
液膜传质系数m/h
C*=P/H,与气相中氧分压相平衡的液体中氧的浓度
N=KL(c*-cL)
KL:
以氧浓度为推动力的总传递系数(m/h)
再令:
单位体积的液体中所具有的氧的传递面积为a(m2/m3)
Nv=KLa(c*-cL)
Nv:
体积传氧速率kmol/m3.h
KLa:
以(C*-CL)为推动力的体积溶氧系数h-1
2、发酵液中氧的平衡
发酵液中供氧和需氧始终处于一个动态的平衡中
传递:
Nv=KLa(c*-cL)
消耗:
氧的平衡最终反映在发酵液中氧的浓度上面。
当发酵过程中的溶解氧浓度不随时间变化时,表明该发酵系统的供氧能力与耗氧量达到了平衡状态,即:
KLa(c*-cL)=QO2.X=r
3、供氧的调节
C有一定的工艺要求,所以可以通过KLa和C*来调节
其中C*=P/H
调节KLa是最常用的方法,KLa反映了设备的供氧能力,一般来讲大罐比小罐要好。
45升1吨10吨
搅拌速度250rpm120120
供氧速率7.610.720.1
(三)影响KLa的因素
KLa反映了设备的供氧能力,发酵常用的设备为摇瓶与发酵罐。
1、影响摇瓶kLa的因素
为装液量和摇瓶机的种类
装液量,一般取1/10左右:
250ml15-25ml
500ml60ml
750ml80ml
500ml摇瓶中生产蛋白酶,考察装液量对酶活的影响
装液量30ml60ml90ml120ml
酶活力71373425392
2、影响发酵罐中KLa的因素
已知在通风发酵罐中,全挡板条件下:
1)理论上分析
提高搅拌,调节KLa的效果显著
2)实际上:
对于转速的调节有时是有限度的
通风的增加也是有限的
蒸发量大
中间挥发性代谢产物带走
所以这些因素的存在,发酵设备的供氧是有限的
3)小型发酵罐和大型发酵罐调节KLa的特点
小型发酵罐,转速可调
大型发酵罐,转速往往不可调
大型反应器的合理设计
对现有设备一定要注意工艺配套
4)影响KLa的其它因素
空气分布器
液体的粘度
(四)溶氧浓度的变化及其控制
1、典型的分批发酵中氧浓度的变化规律(一定KLa下):
一般有一个低谷,在对数生长的末期
2、溶氧控制的策略
发酵过程的控制一般策略:
前期有利于菌体生长,中后期有利于产物的合成
溶氧控制的一般策略:
前期大于临溶氧浓度,中后期满足产物的形成。
3、发酵过程中溶氧浓度监控的意义
1)考察工艺控制是否满足要求
2)其它异常情况的表征
染菌、噬菌体、设备和操作故障
3)间接控制的措施
二)温度的影响
(一)温度对生长的影响
不同微生物的生长对温度的要求不同,根据它们对温度的要求大致可分为四类:
嗜冷菌适应于0~26℃生长,嗜温菌适应于15~43℃生长,嗜热菌适应于37~65℃生长,嗜高温菌适应于65℃以上生长。
(二)温度对发酵的影响
1、温度影响反应速率
发酵过程的反应速率实际是酶反应速率,酶反应有一个最适温度。
温度对菌的生长、产物合成的影响可能是不同的。
2、温度影响发酵方向
四环素产生菌金色链霉菌同时产生金霉素和四环素,当温度低于30℃时,这种菌合成金霉素能力较强;
温度提高,合成四环素的比例也提高,温度达到35℃时,金霉素的合成几乎停止,只产生四环素。
3、温度影响发酵液的物理性质
温度影响基质溶解度,间接影响微生物的生物合成。
氧在发酵液中的溶解度也影响菌对某些基质的分解吸收。
因此对发酵过程中的温度要严格控制。
(三)温度的控制
1、最适温度的选择
1)根据菌种及生长阶段选择
微生物种类不同,所具有的酶系及其性质不同,所要求的温度范围也不同。
如黑曲霉生长温度为37℃,
谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为30~32℃,
青霉菌生长温度为30℃。
根据生长阶段选择
在发酵前期由于菌量少,发酵目的是要尽快达到大量的菌体,取稍高的温度,促使菌的呼吸与代谢,使菌生长迅速。
在中期菌量已达到合成产物的最适量,发酵需要延长中期,从而提高产量,因此中期温度要稍低一些,可以推迟衰老。
因为在稍低温度下合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比较严密有利于产物合成。
发酵后期,产物合成能力降低,延长发酵周期没有必要,就要提高温度,刺激产物合成到放罐。
如四环素生长阶段28℃,合成期26℃后期再升温。
但也有的菌种产物形成比生长温度高,如谷氨酸产生菌生长30~32℃,产酸34~37℃。
最适温度选择要根据菌种与发酵阶段做试验。
2)根据培养条件选择
温度选择还要根据培养条件综合考虑,灵活选择。
通气条件差时可适当降低温度,使菌呼吸速率降低些,溶氧浓度也可高些。
培养基稀薄时,温度也该低些。
因为温度高营养利用快,会使菌过早自溶。
3)根据菌生长情况
菌生长快,维持在较高温度时间要短些;
菌生长慢,维持较高温度时间可长些。
培养条件适宜,如营养丰富,通气能满足,那么前期温度可髙些,以利于菌的生长。
总的来说,温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。
要通过反复实践来定出最适温度。
•2、温度的控制
利用自动控制或手动调整的阀门,将冷却水通入发酵罐的夹层或蛇型管中,通过热交换来降温,保持恒温发酵。
(四)影响发酵温度变化的因素
•产热的因素有生物热(Q生物)和搅拌热(Q搅拌);
散热的因素有蒸发热(Q蒸发)、辐射热(Q辐射)和显热(Q显)。
产生的热能减去散失的热能所得的净热量就是发酵热Q发酵(kJ/m3•h),即:
Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q辐射-Q显
1、生物热Q生物
在发酵过程中,菌体不断利用培养基中的营养物质,将其分解氧化而产生的能量,其中一部分用于合成高能化合物(如ATP)提供细胞合成和代谢产物合成需要的能量,其余一部分以热的形式散发出来,这散发出来的热就叫生物热。
微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多。
•2、搅拌热(Q搅拌)
在机械搅拌通气发酵罐中,由于机械搅拌带动发酵液作机械运动,造成液体之间,液体与搅拌器等设备之间的摩擦,产生可观的热量,即为搅拌热。
•3、蒸发热(Q蒸发)
通气时,引起发酵液的水分蒸发,水分蒸发所需的热量叫蒸发热。
此外,排气也会带走部分热量叫显热Q显热,显热很小,一般可以忽略不计。
。
•4、辐射热(Q辐射)
由于罐外壁和大气间的温度差异而使发酵液中的部分热量能通过罐体向大气辐射,即为辐射热。
辐射热的大小取决于罐温与环境的温差。
冬天大一些,夏天小一些,一般不超过发酵热的5%。
三)发酵过程的pH控制
pH是微生物代谢的综合反映,又影响代谢的进行,所以是十分重要的参数。
发酵过程中pH是不断变化的,通过观察pH变化规律可以了解发酵的正常与否。
(一)发酵过程pH变化的原因
1、基质代谢
(1)糖代谢特别是快速利用的糖,分解成小分子酸、醇,使pH下降。
糖缺乏,pH上升,是补料的标志之一。
(2)氮代谢当氨基酸中的-NH2被利用后,pH会下降;
尿素被分解成NH3,pH上升,NH3利用后pH下降,当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。
(3)生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降。
2、产物形成
某些产物本身呈酸性或碱性,使发酵液pH变化。
如有机酸类产生使pH下降,红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性,使pH上升。
3、菌体自溶,pH上升,发酵后期,pH上升。
(二)pH对发酵的影响
1、实例
例pH对林可霉素发酵的影响
林可霉素发酵开始,葡萄糖转化为有机酸类中间产物,发酵液pH下降,待有机酸被生产菌利用,pH上升。
若不及时补糖、(NH4)2SO4或酸,发酵液pH可迅速升到8.0以上,阻碍或抑制某些酶系,使林可霉素增长缓慢,甚至停止。
对照罐发酵66小时pH达7.93,以后维持在8.0以上至115小时,菌丝浓度降低,NH2-N升高,发酵不再继续。
发酵15小时左右,pH值可以从消后的6.5左右下降到5.3,调节这一段的pH值至7.0左右,以后自控pH,可提高发酵单位。
2、pH对发酵的影响
(1)pH影响酶的活性。
当pH抑制菌体某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻。
(2)pH影响微生物细胞膜所带电荷的改变,从而改变细胞膜的透性,影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄,因此影响新陈代谢的进行。
(3)pH影响培养基某些成分和中间代谢物的解离,从而影响微生物对这些物质的利用
(4)pH影响代谢方向
pH不同,往往引起菌体代谢过程不同,使代谢产物的质量和比例发生改变。
例如黑曲霉在pH2~3时发酵产生柠檬酸,在pH近中性时,则产生草酸。
谷氨酸发酵,在中性和微碱性条件下积累谷氨酸,在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺。
3、pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响
pH对菌体生长影响比产物合成影响小
4、最佳pH的确定
配制不同初始pH的培养基,摇瓶考察发酵情况。
(三)pH的控制
1、调节好基础料的pH。
基础料中若含有玉米浆,pH呈酸性,必须调节pH。
若要控制消后pH在6.0,消前pH往往要调到6.5~6.8。
2、在基础料中加入维持pH的物质,如CaCO3,或具有缓冲能力的试剂,如磷酸缓冲液等。
3、通过补料调节pH。
在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料。
在补料与调pH没有矛盾时采用补料调pH。
如
(1)调节补糖速率,调节空气流量来调节pH。
(2)当NH2-N低,pH低时补氨水;
当NH2-N低,pH高时补(NH4)2SO4
4、当补料与调pH发生矛盾时,加酸碱调pH。
四)发酵过程泡沫的形成与控制
发酵过程起泡的利弊:
气体分散、增加气液接触面积,但过多的泡沫是有害的。
泡沫的定义:
一般来说:
泡沫是气体在液体中的粗分散体,属于气液非均相体系
美国道康宁公司对泡沫这样定义:
体积密度接近气体,而不接近液体的“气/液”分散体。
(一)发酵过程泡沫产生的原因
1、通气搅拌的强烈程度
通气大、搅拌强烈可使泡沫增多,因此在发酵前期由于培养基营养成分消耗少,培养基成分丰富,易起泡。
应先开小通气量,再逐步加大。
搅拌转速也如此。
也可在基础料中加入消泡剂。
2、培养基配比与原料组成
培养基营养丰富,黏度大,产生泡沫多而持久,前期难开搅拌。
在50L罐中投料10L,成分为淀粉水解糖、豆饼水解液、玉米浆等,搅拌900rpm,通气,泡沫生成量为培养基的2倍。
如培养基适当稀一些,接种量大一些,生长速度快些,前期就容易开搅拌。
3、菌种、种子质量和接种量
菌种质量好,生长速度快,可溶性氮源较快被利用,泡沫产生机率也就少。
菌种生长慢的可以加大接种量。
4、灭菌质量
培养基灭菌质量不好,糖氮被破坏,抑制微生物生长,使种子菌丝自溶,产生大量泡沫,加消泡剂也无效。
(二)起泡的危害
1、降低生产能力
在发酵罐中,为了容纳泡沫,防止溢出而降低装量。
2、引起原料浪费
如果设备容积不能留有容纳泡沫的余地,气泡会引起原料流失,造成浪费。
3、影响菌的呼吸
如果气泡稳定,不破碎,那么随着微生物的呼吸,气泡中充满二氧化碳,而且又不能与空气中氧进行交换,这样就影响了菌的呼吸。
4、引起染菌
由于泡沫增多而引起逃液,于是在排气管中粘上培养基,就会长菌。
随着时间延长,杂菌会长入发酵罐而造成染菌。
大量泡沫由罐顶进一步渗到轴封,轴封处的润滑油可起点消泡作用,从轴封处落下的泡沫往往引起杂菌污染。
(三)泡沫的控制
泡沫控制的途径:
1)调整培养基的成分和改变某些发酵条件,如少加或缓加易起泡的培养基成分、改变某些培养条件(如pH、温度、通气搅拌)或改变发酵工艺(如采用分次投料)来控制,以减少泡沫形成的机会。
2)采用机械消沫或消沫剂消沫这两大类方法来消除已形成的泡沫。
3)采用菌种选育的方法,筛选不产生流态泡沫的菌种来消除起泡的内在因素。
(四)常用消泡剂的种类
1、天然油脂
2、聚醚类消泡剂泡敌
3、高碳醇
4、硅酮类
三、发酵过程参数检测和自动控制
•
(一)发酵过程的参数检测
•通过取样分析获得的有关发酵的信息称为参数。
根据参数的性质特点,可分为三类,即物理参数、化学参数和间接参数。
•1、物理参数检测
•物理参数是一类直接参数,主要有温度、生物热、搅拌转速和搅拌功率、通气量、罐压、发酵液黏度、消沫剂和发酵液计量等。
•2、化学参数检测
•化学参数也是直接参数,包括pH值、溶解氧浓度、二氧化碳浓度、细胞浓度、基质浓度、产物浓度等参数。
•1)pH的测量
最通用的pH测定仪是复合pH电极。
这种电极能承受121℃的温度和138N/m2的压力,具有可蒸汽加热灭菌的优点,而且结构紧凑。
pH电极最重要的部分是玻璃微孔膜,若此电极微孔膜部分受蛋白等大分子污染吸附,则影响膜的内外之间的质量传递,pH计的灵敏度和响应时间会下降和延长,此时必须用蛋白酶浸泡使蛋白质酶解溶出。
通常需加装不锈钢保护套才能插入发酵罐中使用。
因为电极内容物会随使用时间尤其高温灭菌而不断变化,故必须在每批发酵灭菌操作前后进行标定,即用标准pH缓冲液校准。
pH电极的标定
•将电极浸入pH6.86的缓冲液(0.2mol/LNa2HPO4 16.47mL,0.1mol/L柠檬酸3.53mL)中,一获得稳定读数就立即将pH表(asymmetry)设定到缓冲液的值。
•将蒸馏水漂洗电极玻璃球泡部位,然后用软纸轻轻擦干,再浸入第二种缓冲液pH9.18(1/15mol/LNa2HPO4)或pH4.0(0.2mol/LNa2HPO4 7.71mL,0.1mol/L柠檬酸12.29mL)中,获得稳定读数后,用斜率电位计(mV/pH)纠正pH值。
如此反复2-3次,直至读数与被测试剂相同并稳定。
以上程序不得颠倒,否则不能获得有效的校准。
•2)溶解氧(DO)的测量
•对于好氧微生物来说,氧的供应十分重要,了解发酵过程中溶氧情况是发酵控制的关键方面。
现在发酵中溶氧测定大多用溶氧电极来测定。
溶氧电极可分为极谱型和原电池型。
•极谱型需极化电压及放大器,耗氧少,受气流影响小
•原电池型简单便宜,适于中小罐。
耗氧较大,受气流和气泡影响大。
•现在国内外测定溶液中的溶解氧基本上用极谱型的复膜氧电极。
•复膜氧电极可分为
•敞口式
•封闭式
敞口式在电极的玻璃管上有一个小孔,使玻璃管与环境相通,这样在蒸汽灭菌时电极玻璃管内外压力相等,有利于保护电极。
封闭式的电极玻璃管上没有小孔,蒸汽灭菌时玻璃管受压大。
现在使用的大多数是敞口式电极。
(1)电极的构造
在阴极银(铂)片的前面包一张半透膜,氧可以透过半透膜达到阴极上进行电极反应。
该半透膜固定在阴极表面。
小孔用于压力补偿。
(2)复膜氧电极的工作原理
阴极由铂、银、金等贵金属组成,阳极由铅、锡、铝等组成。
当给电极施加极谱电压(0.6~0.8V负电压)时,溶液中的氧就在阴极被还原。
当产生的电流与溶液中氧含量成正比时,此时的电极电流为饱和电流,此时的电压为极谱电压。
氧浓度与饱和电流成正比关系。
阴极上失去电子后,阳极反应产生的电子流向阴极,于是在二电极之间形成电流,将氧的信号转变成电信号。
氧浓度越高,电流越大。
化学信号转变成电信号
(3)电极的标定
一般测定时应进行以下二点标定
(a)零点标定
用饱和Na2SO3作无氧状态的溶液,将氧电极放入该溶液中,显示仪表上可见溶氧浓度下降,待下降稳定后,调节零点旋钮显示零值。
(b)饱和校正(满刻度)
进行简便测定时,可以采取空气饱和方式。
将电极放入培养液中,通气搅拌一段时间,显示仪上可见溶氧上升,待上升稳定,调节满刻度旋钮至100%即为饱和值。
•3、间接参数检测
•在微生物培养过程中,可以通过前面所获得的直接参数进一步计算,获得有关培养过程的信息,这些信息就是间接参数。
•间接参数一般是通过在线计算机数据处理、显示或贮存。
(二)发酵过程的自动控制
•发酵过程的自动控制是根据对过程变量的有效测量和对发酵过程变化规律的认识,借助于有自动化仪表和计算机组成的控制器,控制一些发酵的关键变量,达到控制发酵过程的目的。
•发酵过程的自动控制包括三方面内容:
•1)与发酵过程的未来状态相联系的控制目标,如需要控制的温度、pH、生物量和浓度等。
•2)一组可供选择的控制动作,如阀门的开或关、泵的开动或停止等。
•3)能够预测控制动作对过程状态影响的模型,如用加入基质的浓度和速率控制细胞生长率时,表达两者之间关系的数学式。
•这三者是互相联系、相互制约的,组成具有特定自动控制功能的自控系统。
•基本的自动控制系统
•发酵过程采用的基本自控系统主要有前馈控制、反馈控制和自适应控制。
本章小结
•了解发酵过程技术原理,掌握微生物分批发酵、补料-分批发酵、半连续(发酵液带放)发酵和连续发酵的优缺点。
•了解微生物对氧的需求并掌握其中的基本概念;
掌握反应器氧的传递方程,及其参数的测定;
深入理解KLa的意义,掌握发酵过程中溶氧浓度的调节方法,并认识监控溶氧浓度的意义。
•了解温度对生长和发酵的影响;
掌握温度的控制方法;
了解影响发酵温度变化的因素。
•了解发酵过程pH变化的原因;
了解pH对发酵的影响;
掌握pH的控制方法。
•了解发酵过程泡沫产生的原因;
了解起泡的危害;
掌握泡沫的控制方法。
•了解发酵过程中各种参数的检测方法;
了解发酵过程的自动控制系统。
作业
•名词解释:
呼吸强度;
摄氧率
•问答题
•1、试比较微生物分批发酵、补料-分批发酵、半连续(发酵液带放)发酵和连续发酵的优缺点。
•2、溶氧为什么容易成为发酵的限制性因素?
•3、影响生物热的因素有哪些?
•4、发酵过程中的pH如何调节?
•5、泡沫产生的因素有哪几个?
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- 第八章 发酵工艺控制 第八 发酵 工艺 控制