凝胶层析分离混合蛋白实验报告Word文档下载推荐.docx
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从层析柱加入缓冲液,打开出口,将气泡赶走,关闭下端开口,然后加入约6cm的缓冲液,灌注凝胶,打开下端开口。
使其自然沉降高度约17cm,并使其床面覆盖缓冲液,关闭出口盖上小形圆形滤纸。
待凝胶形成后,再用缓冲液洗脱2~3次。
3.样品处理
4.上样和过滤:
吸取约0.5ml混合液,在距离床面1mm处沿管内壁轻轻加入样品。
打开出口,让样品溶液慢慢浸入凝胶内。
凝胶柱面加上一层磷酸盐缓冲液,并用1~2倍体积的此缓冲洗脱。
5.部分收集:
控制速度为0.5ml/min左右,用试管收集洗脱液。
并观察柱上的色带,待黄色
篇二:
生物化学实验报告:
蛋白质分子量的测定——凝胶层析法
实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法
1.掌握凝胶层析的基本原理。
2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。
二、实验原理
凝胶层析法也称分子筛层析法,是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。
当混合物随流动相经过凝胶层析柱时,其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。
该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。
凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质,每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致,像筛子,小的分子可以进入凝胶网孔,而大的分子则排阻于颗粒之外。
当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时,这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。
大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动,流程短,移动速率快,先被洗出层析柱;
而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部,然后再扩散出来,故流程长,移动速度慢,最后被洗出层析柱,从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。
若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质,则居二者之间从柱中流出。
总之,各种不同相对分子质量的蛋白质分子,最终由于它们被排阻和扩散的程度不同,在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同,从而彼此可以分离开来。
将凝胶装在柱后,柱床体积称为“总体积”,以Vt表示。
实质上Vt是由Vo,Vi与Vg三部分组成,Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”,即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积,相应于一般层析法中柱内流动相的体积;
Vi为内体积,即凝胶颗粒内部所含水相的体积。
Vg为凝胶本身的体积。
洗脱体积(Ve)与Vo与Vi之间的关系可用下式表示:
Ve=Vo+KdVi
式中Ve为洗脱体积,自加入样品时算起,到组分最大浓度(峰)出现时所流出的体积;
Kd为样品组分在二相间的分配系数,也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部与外部的分配系数。
它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒
孔隙的大小分布有关,而与柱的长度粗细无关,也就是说它对每一物质为常数,与柱的物理条件无关。
Kd可通过实
验求得,上式可以改写为:
Kd=(Ve-Vo)/Vi
上式中Ve为实际测得的洗脱体积;
Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液(最好是有颜色以便于观察,如血红蛋白,印度黑墨水,分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000等)通过实际测量求得;
Vi可由g×
wr求得(g为干胶重量,单位为克;
wr为凝胶的“吸水量”,以毫升每克表示)。
因此,对一层析柱胶床来说,只要通过实际实验得知某一物质的洗脱体积就可算出它的Kd值。
如果假定蛋白质分子近于球形,同时没有显著的水合作用,则不同大小分子量的蛋白质,在洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量的关系。
在一根凝胶柱中,凝胶颗粒间空隙所含水相体积为外水体积Vo,不能进入凝胶孔径的那些大分子,当洗脱体积为Vo时,出现洗脱峰。
凝胶颗粒内部孔穴的总体积为内水体积Vi,能全部渗入凝胶的那些小分子,当洗脱体积为Vo+Vi时,出现洗脱峰。
Ve与分子量的关系:
对同一类型的化合物,洗脱特性与组分的分子量有关,流过凝胶柱时,按分子量大小顺序流出,分子量大的走在前面。
Ve与分子量的关系可用下式表示:
Ve=K1-K2logm,式中m为相对分子质量,K1和K2为常数,Ve也可用Ve-Vo。
葡聚糖凝胶有不同的型号,用于分离不同相对分子质量大小的物质。
例如sephardexg-75的分级范围是3000-80000的球形分子。
在本实验中用于分离蓝色葡聚糖和牛血清蛋白、胃蛋白酶、cytc。
三、仪器和试剂
1.仪器:
层析柱核酸蛋白检测器(或紫外分光光度计)、自动部分收集器、刻度管。
2.试剂:
蓝色葡聚糖2000、sephardexg-75、洗脱液:
0.2mol/LTris-hcL-KcL,ph7.5。
3.待测样品:
蓝色葡聚糖、牛血清蛋白、胃蛋白酶、cytc。
四、实验步骤
1.凝胶溶胀
凝胶颗粒要求大小比较均匀,可流速稳定,结果较好。
取葡聚糖sephardexg-75干粉,加过量的蒸馏水室温充分溶胀一天(溶胀时间因凝胶交联度不同而不同),或沸水浴中溶胀3小时,这样可大大缩短溶胀时间,而且可以杀死细菌和霉菌,并可排出凝胶内气泡。
溶胀过程中注意不要过分搅拌,以防颗粒破碎。
待溶胀平衡后用倾泻法除去不易沉下的细小颗粒,最后凝胶经减压抽气除去气泡,即可准备装柱。
2.装柱与平衡
装柱前须将凝胶上面过多的溶液倾出,将层析柱垂直装好。
关闭出口,向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液,然后在搅拌下,将浓浆状的凝胶连续地倾入柱中,使之自然沉降,待凝胶沉降约2—3cm后,打开柱的出口,调节合适的流速,使凝胶继续沉集,待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱,关闭出水口。
装柱要求连续、均匀、无气泡、无“纹路”。
将洗脱剂与恒流泵相连,恒流泵出口端与层析柱相连。
通过2—3倍柱床容积的洗脱液使柱床平衡,然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布,以防将来在加样时凝胶被冲起,并始终保持凝胶上端有一段液体。
3.调整洗脱速度
上样前应调整洗脱速度,用自动收集器收集流出液,记录每收集2ml液体所需时间,调整其速度在2min左右。
按上述时间设置自动更换收集管。
3.上样与洗脱
样品上柱是实验成败的关键之一,若样品稀释或上柱不均,会使区带扩散,影响层析效果。
上样时应尽量保持床面的稳定。
先打开柱的出口,待柱中洗脱液流至距床表面1~2mm时,关闭出口,用滴管将1ml样品慢慢地加至柱床表面,应避免将床面凝胶冲起,打开出口并开始计算流出体积,当样品滲入床中接近床表面1mm时关闭出口。
按加样操作,用少量(约1ml)洗脱液冲洗管壁2次。
最后加入少量洗脱液于凝胶上,使高出床表面3~5cm,旋紧上口螺丝帽,柱进水
口连通恒流泵,开始洗脱。
上样的体积,分析用量为柱床容积的1—2%;
制备用量为柱床容积的20%~30%。
4.收集与鉴定
每个收集管内液体用紫外检测仪在280nm波长处检测,出现最高的一个oD值时的体积即为吸收峰的洗脱体积Ve。
5.凝胶柱的处理
凝胶用过后,反复用蒸馏水洗后保存,如果有颜色或比较脏,可用0.5mol/Lnacl洗涤。
短期可保存在水相中,加入防腐剂或加热灭菌后于低温保存。
建议长期用干燥状态保存。
五、实验结果
Ve(ml)
024*********
oD值00.0180.0250.0370.0850.1350.2030.2380.2650.3180.2380.1650.150.0890.034
024681012
牛血清14白蛋白16
182********830
oD值0.0140.0280.0440.0530.090.1130.2580.3870.7780.9951.0030.7620.2620.120.0540.027oD值0.0130.0150.0310.0490.0570.1410.167
蓝色葡聚糖-2000
胃蛋白酶
Ve(ml)oD值
00.01720.01940.05160.07780.085100.098120.15
cytc
141618202224262830
0.1840.2530.2960.3130.180.0920.0780.0630.036
141618202224262830320.2110.2630.3850.4890.5920.2630.2110.1130.0770.02
做出洗脱曲线:
蓝色葡聚糖
-2000
牛血清蛋白
篇三:
凝胶层析试验报告
摘要
凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分技术,由于设备简单、操作方便,不需要有机溶剂,对高分子物质有很高的分离效果。
凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。
根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物,又可分为凝胶过滤色谱(gFc)和凝胶渗透色谱(gpc)。
gFc一般用于分离水溶性的大分子,如多糖类化合物。
本实验用凝胶色谱法对食用油中的甘油三酯进行了分离提取。
关键词:
凝胶色谱甘油三酯食用油
第一章简介
凝胶层析法凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。
它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体,不带电荷,吸附力弱,操作条件比较温和,可在相当广的温度范围下进行,不需要有机溶剂,并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。
对于高分子物质有很好的分离效果。
一、凝胶的选择
根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。
如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开,由于它们在分配系数上有显著差异,这种分离又称组别分离,一般可选用sephadexg-25和g-50,对于小肽和低分子量的物质(1000-5000)的脱盐可使用sephadexg-10,g-15及bio-gel-p-2或4。
如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离,这种分离又叫分级分离。
一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶,层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部,由于Kd不同,最后得到分离。
二、柱的直径与长度
根据经验,组别分离时,大多采用2-30cm长的层析柱,分级分离时,一般需要100cm左右长的层析柱,其直径在1-5cm范围内,小于1cm产生管壁效应,大于5cm则稀释现象严重。
长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间,但对移动慢的物质宜在30-40之间。
三、凝胶柱的制备
凝胶型号选定后,将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀,溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。
自然溶胀费时较长,加热可使溶胀加速,即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸,1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。
加热法既可节省时间又可消毒。
凝胶的装填:
将层析柱与地面垂直固定在架子上,下端流出口用夹子夹紧,柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器,柱内充满洗脱液,将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中,然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内,这样凝胶粒水平上升,直到所需高度为止,拆除柱顶装置,用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床
表面。
稍放置一段时间,再开始流动平衡,流速应低于层析时所需的流速。
在平衡过程中逐渐增加到层析的流速,千万不能超过最终流速。
平衡凝胶床过夜,使用前要检查层析床是否均匀,有无“纹路”或气泡,或加一些有色物质来观察色带的移动,如带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好,色带出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。
四、加样和洗脱
凝胶床经过平衡后,在床顶部留下数亳升洗脱液使凝胶床饱和,再用滴管加入样品。
一般样品体积不大于凝胶总床体积的5%-10%。
样品浓度与分配系数无关,故样品浓度可以提高,但分子量较大的物质,溶液的粘度将随浓度增加而增大,使分子运动受限,故样品与洗脱液的相对粘度不得超过1.5-2。
样品加入后打开流出口,使样品渗入凝胶床内,当样品液面恰与凝胶床表面相平时,再加入数毫升洗脱液中洗管壁,使其全部进入凝胶床后,将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连,预先设计好流速,然后分部收集洗脱液,并对每一馏份做定性、定量测定。
五、凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存
一次装柱后可以反复使用,不必特殊处理,并不影响分离效果。
为了防止凝胶染菌,可在一次层析后加入0.02%的叠氮钠,在下次层析前应将抑菌剂除去,以免干扰洗脱液的测定。
如果不再使用可将其回收,一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干,依次用70%、90%、95%乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90%以上,滤干,再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。
湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性,密封后高压灭菌保存。
六、凝胶层析的应用
1.脱盐:
高分子(如蛋白质、核酸、多糖等)溶液中的低分子量杂质,可以用凝胶层析法除去,这一操作称为脱盐。
本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。
适用的凝胶为sephadexg-10、15、25或bio-gel-p-2、4、6。
柱长与直径之比为5-15,样品体积可达柱床体积的25%-30%,为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上,一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡,然后加入样品,再用同样缓冲液洗脱,收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。
2.用于分离提纯:
凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生
物碱等物质的分离提纯。
凝胶对热原有较强的吸附力,可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。
3.测定高分子物质的分子量:
用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内,在同一条件下层析,记录每一分钟成分的洗脱体积,并以洗脱体积对分子量的对数作图,在一定分子量范围内可得一直线,即分子量的标准曲线。
测定未知物质的分子量时,可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗肿后,根据物质的洗脱体积,在标准曲线上查出它的分子量。
4.高分子溶液的浓缩:
通常将sephadexg-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中,这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中,而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外,再经离心或过滤,将溶胀的凝胶分离出去,就得到了浓缩的高分子溶液。
第二章实验内容
通过从粗油中分离甘油三酯,学习运用凝胶色谱法分离油脂中各个成分的方法。
吸附色谱是利用吸附剂对被分离物质的吸附能力不同,用溶剂或气体洗脱,以使组分分离。
常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。
硅胶色谱频繁使用在脂质中的单一脂质,糖脂质以及磷脂质的分离。
各种脂质被硅胶吸附,随着洗脱溶液的极性增加,各种极性不同的化合物被分离出来。
三、实验材料与试剂
正己烷200mL、、乙醚15mL、蒸馏水1.3mL、硅胶(100目左右)25g
四、实验仪器
层析柱(1.5×
75cm)、250mL三角容量瓶、分析天平(0.001g)、真空浓缩装
置、搜集瓶
五、实验提取工艺流程
1.活化硅胶(110度,6小时干燥)25g中加入5%蒸馏水使其部分钝化并充分混匀放置30分钟。
加入正己烷至刚好淹没硅胶为止并用超声波脱气3分钟。
2.层析柱底部放入脱脂棉少许(防止硅胶泄漏),将硅胶放入到层析柱中正己烷溶液要没过硅胶层表面。
3.准确称取食用油1±
0.001g加入到硅胶层析柱中用150mL正己烷/乙醚(87∶13,v/v)洗脱,洗脱速度为2-3滴/min。
洗脱时表面不能干和。
4.收集的洗脱液用真空浓缩装置浓缩至无有机溶剂气味为止。
5.准确称取浓缩物质量
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- 凝胶 层析 分离 混合 蛋白 实验 报告