临床微生物学检验感染球菌Word下载.docx
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铁锈色痰---肺炎链球菌
砖红色痰---克雷伯菌
黄绿色痰---铜绿假单胞菌
脓痰有恶臭---厌氧菌
3.腹泻
(1)感染性腹泻:
细菌性病毒性寄生虫感染性
菌痢---里急后重、粘液脓血便
霍乱---无色或淘米水样便
阿米巴痢疾---果酱样便,恶臭
非感染性腹泻:
由肿瘤、吸收不良、功能性和药物不良反应性等多种原因引起
有诊断意义的特殊症状和体征
感染性疾病
特殊症状和体征
病原体
伤寒
无欲貌,伤寒玫瑰疹
伤寒沙门菌
流行性出血热
酒醉样面容
汉坦病毒
狂犬病
惊恐不安,对声、光、风等极为过敏,并伴喉头紧缩感,伤口附近感觉异常,有麻、痒、痛及蚁咬感
狂犬病毒
钩端螺旋体病
腓肠肌刀割样疼痛
钩端螺旋体
登革热
剧烈肌肉和骨关节疼痛,呈屈背弯腰的体态
登革病毒
百日咳
阵发性痉挛性咳嗽伴高音调的鸡鸣样吼声
百日咳杆菌
霍乱
无痛性腹泻,腹直肌痉挛性腹痛,无里急后重,米泔水样便,无粪臭
霍乱弧菌
第二节感染的流行病学证据
一、感染性疾病流行的基本要素
1.传染源
(1)患者
(2)隐性感染者
(3)病原携带者
(4)受感染的动物
2.传播途径
(1)空气、飞沫、尘埃
(2)水、食物、苍蝇
(3)手、用具、玩具
(4)吸血节肢动物
(5)血液、体液、血制品
(6)土壤
3.人群易感性
易感者在某一特定人群中的比例决定该人群的易感性
二、有利于感染诊断的其他要素
年龄:
麻疹、水痘、乙脑、带状疱疹
职业:
布氏杆菌病、炭疽、血吸虫病、乙肝
接触史和生活习惯:
麻疹、甲肝、乙肝、丙肝、艾滋病、狂犬病、弓形虫病、隐球菌感染、鹦鹉热;
华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病、姜片虫病、钩虫病等
旅行及居住变迁情况:
输入性传染病,如黄热病、艾滋病
第三节感染的病原学证据
柯赫法则与感染的病原学证据
1.病原微生物一定存在于感染性疾病个体中,而在健康的个体中不存在
ô
2.一定能分离和纯培养所怀疑的病原微生物
3.用分离的病原微生物接种敏感的动物模型时可导致相同的疾病
4.相同的病原微生物可再次从这种被感染的动物模型中分离到
柯赫法则完善与发展
1.某些微生物不能获得体外纯培养
2.某些感染无相应的动物模型
3.某些不致病细菌转变为致病菌
细菌感染的病原学证据
(一)镜检证据革兰染色——最常用
部分可用于初步诊断的镜检证据抗酸染色免疫荧光染色
(二)培养鉴定证据
细菌分离培养基
培养基
应用
营养培养基
血琼脂、巧克力琼脂
选择培养基
SS琼脂、HE琼脂
鉴别培养基
硫化氢培养基
厌氧培养基
卡那-万古霉素血琼脂、胆汁七叶苷琼脂
分枝杆菌培养基
罗氏培养基
1.观察菌落形态2.溶血性3.产色素情况4.培养条件5.鉴定
细菌的溶血特征
溶血
细菌
甲型溶血
肺炎链球菌、草绿色链球菌
乙型溶血
化脓性链球菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、单核李斯特菌、产气荚膜梭菌
丙型溶血
肠球菌、D群链球菌、草绿色链球菌
细菌基本生化特性
生化特性
触酶(革兰阳性)
阳性葡萄球菌属、多数革兰阳性需氧杆菌(李斯特菌属、芽孢杆菌属、棒状杆菌属)
阴性链球菌属、肠球菌属
凝固酶(革兰阳性)
阳性金黄色葡萄球菌
阴性表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌等
(三)免疫学证据
1、抗原检测:
鉴定菌种、菌型,如玻片凝集试验、对流免疫电泳
2、抗体检测:
血清学试验,如肥达试验
(四)核酸证据
1.基因探针
2.PCR
3.基因芯片
三、真菌感染的病原学证据
1.镜检证据
高倍镜或油镜检测菌丝、孢子
直接涂片法:
如KOH湿片法
染色涂片法:
革兰染色、乳酸酚棉蓝染色、印度墨汁染色
染色方法临床应用
革兰染色属细菌鉴别染色法,也用于真菌。
假丝酵母菌和隐球菌呈革兰阳性。
乳酸酚棉篮染色适合真菌染色的强酸性染料,主要用于丝状真菌及其培养后特征性的分生孢子的染色。
印度墨汁染色在黑色的背景中使细菌荚膜或真菌孢子周围呈现透亮区,常用于自脑脊液标本的产荚膜的细菌和隐球菌。
刚果白染色荧光素与真菌细胞壁上的纤维素结合,在紫外光激发下,发出篮白色荧光。
适用于各种临床标本的真菌检测。
与KOH合用,荧光色更亮。
果莫里六胺银染色常用于真菌和肺囊虫的包囊期染色。
主要用于鉴定肺、支气管组织中的肺囊虫和各种组织和细胞中的真菌,是测定真菌各成分的最好方法。
过腆酸锡夫染色可以使真菌各成分着色,迅速鉴定菌丝型霉菌和酵母,诺卡氏菌难染色,皮炎芽生菌呈多色。
2.培养证据
培养基:
加抗生素
培养温度:
25-28℃、35℃
菌落形态
双相性真菌
3.免疫学证据
4.核酸证据
四、病毒感染的病原学证据
(一)镜检证据
光学显微镜检查
电子显微镜检查
适应症
(二)培养的证据
培养细胞中是否有病毒复制的方法有:
①观察病毒感染细胞后出现的细胞病变效应(CPE)
②观察病毒感染细胞的红细胞吸附现象
③检测病毒感染细胞分泌的干扰素
④通过荧光抗体技术检测病毒感染细胞中的病毒抗原
1、抗原检测
2、血清学检测
(四)核酸证据
基于核酸的检测技术临床主要用于:
①肠道病毒感染性脑膜炎
②单纯疱疹病毒性脑炎
③HIV的诊断和疗效监测
④HCV的诊断和疗效监测
⑤器官移植或艾滋病患者合并CMV感染
⑥EBV与移植后淋巴组织增生症
⑦呼吸道病毒感染
五、寄生虫感染的病原学证据
大体形态
镜下形态
培养孵育
免疫学证据
核酸证据
原虫感染的证据
粪便标本检测
阿米巴
血液和组织标本检验
疟原虫
蠕虫感染的证据
虫卵检查方法
虫卵的特征
其他检测方法
第四章病原生物学诊断技术
总述
病原生物学诊断技术
概念:
病原生物学诊断技术是用微生物学及寄生虫学基本知识和技术,结合临床实际对病人标本进行检验的技术方法。
主要内容:
病原生物的分离培养
病原生物代谢产物的检测
机体感染后的免疫应答产物的测定等
诊断的目的
1.以疾病的病原学诊断为目的,只需鉴定到细菌的种。
2.以提供治疗方案为目的,要进行临床标本的直接药物敏感试验。
对分离的病原菌也要进行药敏试验-提供可靠的治疗方案
3.以流行病学研究为目的,要鉴定到型。
4.以了解细菌与感染的关系为目的,应该做细致的鉴定。
诊断试验的选择
1.选择有鉴定价值的试验。
2.选择简易、快速、方便的试验,达到目的即可
3.综合考虑试验的敏感性和特异性。
敏感性=阳性结果数/感染病人数,越高假阴性就越少。
特异性=阴性结果数/未感染病人数,越高假阳性就越少。
敏感性&特异性:
敏感性上升,特异性下降
所谓敏感性,就是指其在诊断疾病的时候不漏诊(假阴性)的机会有多大(小),所谓特异性就是指该指标在诊断某疾病时,不误诊(假阳性)的机会有多大(小)
结合临床进行进一步的诊断。
☞疾病的种类不断发生变迁,由条件致病菌引起的内源性感染明显增多。
同时,新的病原菌不断出现,原有的病原菌因变异、耐药等又重新流行。
☞既不能轻易认为分离出的非致病菌是污染菌,也不要轻易认为所发现的细菌就是该感染的病原菌,
常用诊断流程
1.双歧索引
用于易区分、有特征的细菌,如革兰阴性杆菌初步分群;
对于相互区别较难的细菌,鉴定项目较多,用起来不太方便。
2.表解法:
将各种细菌及其多种特性列成矩阵表格,使相互的区别点十分明显,便于分析比较。
此法对于相互区别比较复杂的细菌,如肠杆菌科的初步分属。
3.数字编码鉴定法
将所得生化反应模式转化成数学模式,可把细菌生化反应结果转化成数字,经检索手册又可将转化成细菌名称。
与电脑分析软件配套,形成了半自动或全自动细菌分析系统。
临床标本的采集与处理
一、标本采集的一般原则
1.早期采集病程早期、急性期或症状典型时,使用抗生素前。
2.无菌采集应无污染,严格进行无菌操作。
3.根据目的菌的特性用不同的方法采集厌氧,需氧
4.适量标本,有代表性标本。
采集量不应过少。
注意在不同病程采集不同部位标本。
5.采集标本时要防止传播和自身感染。
二、标本的处理
1.标本保存在4℃环境中,在2h之内送检。
特殊标本要按照要求保存。
用于细菌培养的标本保存时间不应超过24h。
对环境敏感的细菌应保温并立即送检。
2.标本中可能含有致病菌,必须注意安全防护。
切勿污染环境。
对于烈性传染病标本运送时更要由专人运送,严格按规定包装。
3.厌氧性标本应放在专门的运送瓶或试管内运送,有时可直接用抽取标本的注射器运送。
病原微生物检测的常用方法
显微镜检查:
不染色标本、染色标本
分离培养:
毒素检测:
内毒素、外毒素
生化反应:
分解性代谢性产物
免疫学技术:
荧光免疫技术、酶免疫技术
分子生物学技术:
核酸杂交技术
聚合酶链反应
生物芯片技术
第一节显微镜检查
确定有无病原体
观察形态结构染色特征,为后续做准备
有些标本可根据形态学做出初步诊断
一显微镜
普通光学显微镜:
通过油镜放大1000倍
暗视野显微镜:
活的病原体的形态、运动现象等
相差显微镜:
不染色病原体形态
某些内部结构
荧光显微镜:
各种病原生物
电子显微镜:
细菌超微结构
表面结构及附件
激光共聚焦显微镜:
激光共聚焦显微镜
在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置,并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。
对观察样品进行断层扫描和成像。
因此,可以无损伤的观察和分析细胞的三维空间结构。
同时,通过激光扫描共聚焦显微镜也是活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记观察的有力工具。
二、不染色标本检查
1.主要用于检查生活状态下细菌的动力及运动状况。
可对某些病原菌作出初步鉴定,如霍乱弧菌。
2.螺旋体由于不易着色并有形态特征,故多用不染色标本作暗视野显微镜检查。
(1)压滴法
(a)制备菌悬液。
取出1ml菌液稀释至肉眼看不到混浊为止。
(b)取2—3环稀释菌液,放在载玻片中央,(放一环万分之一的美蓝水溶液混匀。
)
(c)用镊子夹一洁净的盖玻片,使其一边先接触菌液,然后将整个盖玻片慢慢放下,注意不要产生气泡。
(d)先以低倍镜找到标本,再用高倍镜观察,观察时光线要调得暗些。
(2)悬滴法
(a)在洁净盖玻片周围涂少许凡士林。
(b)在盖玻片中央滴一小滴菌液,
(c)将凹玻片反转,使凹窝中心对准盖玻片上的菌液滴,液滴不得与凹玻片接触,轻压使盖玻片与凹玻片粘在一起,液滴处于封闭的小室中,防止液滴干燥和气流的影响。
(d)小心将凹玻片翻转过来,使菌滴仍悬浮在盖玻片下和凹窝中心
(e)先用低倍镜找到悬滴边缘,再用高倍镜观察。
观察时光线要调得暗一些。
细菌的运动有一定的前进方向,并可转弯,单鞭毛菌类多为直线运动,周鞭毛菌多作波浪式运动。
三染色标本的检查
利于观察细菌的形态、大小、排列方式
还可根据染色反应将细菌进行分类。
一)常用染料
用于细菌染色的染料,多为人工合成的含苯环的有机化合物。
色基与助色基。
带有色基的苯环化合物--色原;
虽然本身带色,但与被染物无亲和力而不能使之着色。
助色基并不显色,但它本身能解离,解离后的染料可以与被染物结合生成盐类,使之着色。
根据助色基解离后的带电情况,可将染料分为碱性和酸性两大类。
碱性染料:
碱性复红、结晶紫、美蓝等。
电离后显色离子带正电荷→易与带负电荷的被染物结合。
细菌PI2-5之间→在碱性、中性、弱酸性环境中→带负电荷
酸性染料:
有伊红、刚果红等。
电离后显色离子带负电荷→易与带正电荷的被染物结合。
通常用来染细胞浆
细菌不易着色→降低菌液pH使细菌带正电荷→可被染色
复合染料(中性染料):
碱性染料和酸性染料的复合物。
瑞氏染料(伊红美蓝)、姬姆萨染料(伊红天青)等。
常用于特殊染色技术。
荧光染料:
异硫氢酸荧光素、罗丹明等。
常用于免疫学诊断技术。
(二)常用方法
种类:
正染色法:
细菌着色
单染色法:
一种染料。
观察细菌形态、大小和排列特征。
复染色法:
两种以上染料
革兰染色、抗酸染色和荧光染色。
负染色法:
细菌不着色,背景着色。
因为不做热固定抹片,所以菌体为活体。
☆负染色法(Negativestaining)
原理
利用酸性染色,因染剂的负电性无法通过细胞表面,因此透明的细胞可以藉此与背景区别。
步骤
1将少许染剂滴在玻片一端
2用过火后的接种环或无菌的牙签少量沾取菌体,小心将菌体打散于染剂中
3利用另一玻片以约45度斜角与原玻片接触
4将玻片往另一端推开延展,制作抹片,即可镜检
☆革兰染色(Gramstain):
最经典、最常用的染色方法。
原理:
细胞壁、等电点、胞浆中核糖核酸镁盐
方法:
结晶紫(初染)--碘液(媒染)--95%酒精(脱色)—复红或沙黄(复染)
结果:
紫色--革兰阳性菌;
红色--革兰阴性菌
意义:
鉴定细菌:
染色性、基本形态
初步确定致病物质
选择抗生素的参考
结合细菌特殊结构及排列方式,对病原菌可进行鉴定,其结果为临床早期诊断及治疗提供了依据。
革兰染色可为临床选择用药提供参考,帮助临床制订有针对性的治疗方案。
因为G+菌和G-菌对抗生素敏感性不同,且致病物质及其作用机理也不同。
☆抗酸染色法
分枝杆菌细胞壁具有分枝菌酸与石炭酸
复红结合成牢固的复合物,能抵抗5%盐酸
酒精的脱色,而使菌体呈红色。
石炭酸复红--加热3~5min--5%盐酸酒精脱色—碱性美蓝复染--镜检
红色--抗酸性细菌;
蓝色--非抗酸性细菌
鉴定分枝杆菌
抗酸染色将细菌分为抗酸性和非抗酸性细菌两大类。
因为大多数病原菌为非抗酸性,所以抗酸染色不作为常规检查项目。
只用于结核病等检查。
抗酸染色的鉴定结果。
对疾病的诊断和治疗具有重要参考价值。
1、细菌涂片标本的制备
涂片干燥固定
2、染色
1)初染:
用玻片夹夹持涂片标本,滴加石炭酸复红,在火焰高处徐徐加热,切勿沸腾,出现蒸汽即暂时离开,若染液蒸发减少,应再加染液,以免干涸,加热3-5分钟,待标本冷却后用水冲洗。
2)脱色:
3%盐酸酒精脱色30’’~1’;
水洗。
3)复染:
用碱性美兰溶液复染1’,水洗后用吸水纸吸干。
3、结果观察结核杆菌呈红色,常堆积成团,排列无序,偶呈分枝状生长。
背景及非抗酸性细菌呈兰色。
注意事项
1、无菌操作
2、涂片厚度要适中
3、固定
4、冲洗
5、染色时间足够。
6、初染加热的温度,勿沸腾。
☆荧光染色:
具有敏感性强、效率高、易观察等特点。
用于细菌、病毒及寄生虫等的检测。
☆异染颗粒染色:
白喉棒状杆菌
☆特殊染色:
鞭毛染色、芽胞染色、荚膜染色
第二节分离培养
细菌培养特性及生长特征是细菌生物学特性之一,不同种类细菌可有不同培养特性及生长特征。
因此,了解培养特性并观察细菌生长特征对细菌鉴定和鉴别非常有帮助。
一细菌的分离培养
细菌生长繁殖的条件:
4条
营养物质是必不可少的。
♣培养基
将细菌生长繁殖所需的各类营养物质按照一定比例配制而成的营养基质,主要用于分离纯种细菌、传代保存细菌、鉴别细菌、研究细菌的生理生化特性和研制疫苗等。
培养基的种类--根据组成分类
合成培养基:
用已知化学成分的物质配制而成
特点:
组成成分精确、重复性好,但价格较昂贵。
用途:
适用于实验室研究
天然培养基:
用化学成分尚不清楚或不恒定的天然有
机物质制成。
如肉浸汁、蛋白胨等
经济
适用于大规模培养和生产及实验室
培养基的种类--根据物理性状分类(凝固剂)
液体(infusionmedium):
常用于增菌培养,也用于细菌生长的动态观察
固体培养基(solidmedium):
液体培养基中加入1.5%~2%琼脂。
用于分离培养细菌、鉴定细菌、选择培养以及药
敏试验。
斜面固体培养基用于菌种短期保存。
半固体培养基(semi-solidmedium):
液体培养基中加入0.2%~0.5%琼脂。
用于细菌动力试验及菌种保存,可根据细菌营养
要求加入特殊营养成分。
培养基种类--根据用途分类:
培养基的组成成分
营养物质:
水
碳源--糖类、有机酸和氨基酸等
氮源--铵盐、氨基酸、肽等
无机盐--钾、镁、锰、钙、锌、铁、铜等特殊生长因子
凝固剂:
琼脂、明胶和硅胶三种
抑菌剂:
抑制杂菌生长。
如胆盐、煌绿、孔雀绿、
蔷薇酸、亚硫酸铋等
指示剂:
常用有酚红、溴甲酚紫、溴麝香单酚蓝、
溴酚红、甲基红、酸性复红、中国蓝等
培养基的制备
制备程序:
调配与溶化—
调整pH—
过滤澄清—
分装—
灭菌—
无菌检测与质控—
保存--
灭菌方法的选择
细菌的分离培养技术
细菌接种方法--平板划线法:
分区划线法:
含菌量较多的标本(如脓汁、粪便等)
连续划线法:
含菌量较少的标本
细菌接种方法
斜面接种法:
纯种增菌及保存菌种
穿刺接种法:
半固体、双糖、明胶等培养基垂直刺入至距管底约0.4cm处
细菌接种方法--倾注平板法:
纯培养物(稀释液或原液)→加至已融化并冷到50℃琼脂管→倾注于无菌平皿→凝固后培养→菌落计数
兼性厌氧菌或厌氧菌定量培养;
饮料、牛乳和尿液等液体标本活细菌计数。
细菌接种方法--液体接种法:
试管直立后液体应淹没接种物
多用于一些液体生化试验管的接种
细菌接种方法--涂布接种法:
用途:
纸片法药物敏感性测定、被检标本中的细菌计数
定量被检菌液→琼脂平板表面→L型玻璃棒反复涂布→被检标本均匀分布在琼脂表面→药物纸片→培养→观察结果
细菌的培养方法
普通培养
二氧化碳培养
微需氧培养
厌氧培养
小结:
培养条件:
温度、气体环境、培养基的pH、特殊营养要求(嗜血、嗜盐、生长因子等)
菌落特征:
形态、大小、溶血、色素、气味等
培养基的制备及用途
第七章球菌
第一节葡萄球菌属
一、分类
伯杰鉴定细菌学手册,35个种、17个亚种
凝固酶(coagulase):
凝固酶阳性葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌
噬菌体分型:
将金黄色葡萄球菌分为5群26型
二、临床意义
1.侵袭性疾病:
皮肤感染、内脏感染、全身感染
2.毒素性疾病:
食物中毒、烫伤样皮肤综合症、毒性休克综合症
致病物质
酶:
血浆凝固酶、耐热核酸酶、透明质酸酶等
毒素:
杀白细胞毒素、表皮剥脱毒素、肠毒素、葡萄球菌溶血素、中毒性休克综合征毒素-1等
三、形态和培养特性
一)形态染色
直径0.5~1.5μm
革兰阳性球菌
排列呈葡萄串样
无鞭毛和芽胞
除少数菌株一般无荚膜
二)培养特性
营养要求不高
普通培养基上形成1~3mm呈金黄色、白色、柠檬色等不透明圆形凸起菌落
血琼脂平板上有透明溶血环
能在10%~15%NaCl琼脂中生长
卵黄高盐琼脂:
金黄色、圆形突起,边缘整齐,外周有卵磷脂被分解的乳白色混浊圈
四、种属鉴定
1、标本采集
ä
按常规方法采取标本
采取标本应避免正常菌群污染
粪便标本接种选择平板,如甘露醇高盐平板
2、鉴定特征
葡萄串样排列的革兰阳性球菌
兼性厌氧
触酶阳性
氧化酶阴性
10%NaCl条件中生长
3、菌种鉴定试验
★凝固酶试验
结合凝固酶
游离凝固酶
金黄色葡萄球菌阳性
(1)玻片凝固酶试验:
金黄色葡萄球菌有结合型凝固酶(聚集因子),与血浆中的纤维蛋白原交联
(2)试管凝固酶试验:
分泌到菌体外的凝固酶被血浆中的协同因子激活形成复合物,使纤维蛋白原转变成纤维蛋白
37℃水浴
3~4小时凝固(+);
24小时不凝(-)
★耐热核酸酶试验
★碱性磷酸酶试验
★吡咯烷酮β萘基酰胺试验
耐热核酸酶试验
多数金黄色葡萄球菌、施氏葡萄球菌、中间葡萄球菌、猪葡萄球菌产生耐热核酸酶
将待检菌的过夜肉汤培养物置沸水浴15min后,滴加于含甲苯胺蓝核酸琼脂上已打好的直径为2~5mm小孔内,置35℃孵育,1h~3h后观察结果,绕孔周围蓝色琼脂转变为粉红环为阳性。
同时设阴阳对照
磷酸酶试验
多数表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌、施氏葡萄球菌、中间葡萄球菌和猪葡萄球菌为阳性
将待测菌点种在加有硝基酚磷酸盐的MH琼脂上,18~24h,菌落周围出现黄色为阳性
PYR(吡咯烷酮芳基酰胺酶)试验:
溶血葡萄球菌、里昂葡萄球菌、施氏葡萄球菌和中间葡萄球菌为阳性
将孵育24h斜面培养物接种在
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