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oriC的9bp区富含A和T,DnaA蛋白的结合使这一区域容易解链(melted),并形成复制起始的开放型复合物(opencomplex),这个过程消耗ATP。
dnaC蛋白将dnaB蛋白运送到指定位置解旋酶DnaB蛋白介导E.coli的染色体DNA必须进一步解旋。
复制开放复合物中的每1条单链上各有1个解旋酶分子结合。
而形成预引发复合物(preprimingcomplex)。
*****E.coli的SSB蛋白结合于DNA单链区,以防止DNA再退火(reannealing),此外,SSB蛋白可以防止形成局部发夹式螺旋阻碍DNA聚合酶前进。
(二)引发
DNA复制都需要引发酶合成RNA引物。
这些RNA引物5,端第1个核苷酸通常是pppA,个别为pppG,其长度从几个核苷酸(4~5个)到十几个不等,它们的前1~2个核苷酸往往是固定的,后面的可以是任意的核苷酸,也可能从DNA模板链上拷贝。
------引发酶、DnaB和几种蛋白因子形成的复合物叫作引发体(primosome),它能沿着结合了SSB蛋白的DNA单链定向运动,并在不同位点合成RNA引物。
(三)半不连续复制
在E.coli复制叉,前导链的连续合成比较简单。
滞后链合成分段进行,需要合成若干RNA引物,DNA聚合酶Ⅲ可以在RNA引物的3'端开始合成罔崎片段(Okazakifragments),在细菌和噬菌体中它的长度一般为1000—2000个核苷酸,但在真核细胞中只有100—200个核苷酸。
当每个新合成的罔崎片断3'端到达相邻的另1个罔崎片段的5'端时,DNA聚合酶I利用其5'→3',外切酶活性切除后者5'端的RNA引物,同时利用它的DNA聚合酶活性填补两个罔崎片段之间的缺口。
然后,另1个关键酶——DNA连接酶(1igase)——将相邻的这两个罔崎片段的3'羟基和5'磷酸基团连接起来。
DNA聚合酶I,从N端到C端有3个酶促活性结构域依次排列:
5'→3'外切酶和3'→5'外切酶和DNA聚合酶。
在DNA损伤修复时,DNA聚合酶I对于填补缺口(gapfilling)可能是最重要的酶。
DNA聚合酶Ⅱ兼有3'→5'外切酶和DNA聚合酶活性。
DNA聚合酶Ⅱ能够在DNA的两条链在同一部位都发生损伤时进行DNA修复。
只有DNA聚合酶Ⅲ符合E.coli体内DNA复制的要求,DNA聚合酶Ⅲ在E.coli的DNA复制中是主要的DNA合成酶。
DNA聚合酶Ⅲα亚基具有DNA聚合酶活性,而ε亚基具有3'→5'为外切酶活性,它对于校正功能十分重要。
θ亚基可能起组装作用。
其他7种亚基的主要功能是,将核心聚合酶从分配型酶(distributiveenzyme)转变成持续型酶(processiyeenzyme)。
DNA聚合酶Ⅲ之所以具备持续合成能力,β亚基二聚体起了关键作用,它的主要功能是防止核心聚合酶在DNA复制过程中从模板链上掉下来。
(四)复制的终止位点和Tus蛋白
E.coli的两个复制叉的汇合点就是复制的终点,在复制叉汇合点两侧约lOOkb处各有1个终止区(terD,A和terC,B),它们是向1个方向运动的复制叉特异的终止位点(TERsites),4个ter序列中都含有1个23bp的共有序列,Tus蛋白(36Kd)识别和结合于终止位点的23bp共有序列,它具有反解旋酶(contra—helicase)的活性,以阻止DnaB蛋白的解旋作用,从而抑制了复制叉的前进。
------复制体(replisome)是在复制叉形成的1种多蛋白复合物,其中包括DNA聚合酶等酶和蛋白因子,它的功能是促使DNA复制。
四、真核细胞的DNA复制
在哺乳动物细胞中发现了5种DNA聚合酶(αβγδε)。
哺乳动物的DNA聚合酶α和δ分别负责合成滞后链和前导链,β和ε可能和DNA损伤修复有关,而γ负责合成线粒体DNA
(二)端粒和端粒酶
真核生物线性染色体的末端具有特殊结构——端粒(telomeres)。
端粒由特异的寡聚核苷酸重复序列组成,端粒不仅对于染色体的稳定性十分重要,而且为染色体DNA复制所必需。
------端粒酶(telomerase),它是1种核糖核蛋白(RNP),可以利用自己的RNA分子作为模板,从3'端合成并延长滞后链模板DNA。
一旦滞后链模板的3'端延伸到足够长,就可以完整地合成滞后链的最后1个岡崎片段,产生完整的子染色单体。
某些基因组的DNA复制特征和原核或真核生物的染色体DNA复制明显不同,例如线粒体DNA的D—环(D-Loop)复制和噬菌体的滚环(rollingcircle)复制。
DNA复制的高度忠实性有赖于多种因素,包括RNA引物的作用,DNA聚合酶的自我校正功能,几种校正和修复系统,以及DNA本身的结构特征(T取代U)等,
(二)错配校正系统
E.coli的错配校正系统利用dam基因编码的甲基化酶(methylase),将DNA所有的GATC序列中的A在N6位甲基化,新合成的DNA链中的A要晚一些时候才被甲基化。
这就为区别新DNA链和模板链提供了基础。
E.coli的错配校正过程始于三种蛋白发挥作用,它们是MutS,MutL和MutH。
MutS可以识别和结合于DNA的错配碱基处,MutH在新DNA链(尚未甲基化)的GATC的5'侧造成缺口(nick),而MutL将MutS和MutH连结在一起,从而使新合成的DNA链和模板链形成环状结构(looping)。
然后,在DNA解旋酶Ⅱ和SSB蛋白等因子参与下,核酸外切酶I切除新DNA链上包括错配碱基在内的片段。
最后,由DNA聚合酶Ⅲ和连接酶完成修复。
真核生物新合成的DNA链上往往带有缺口,这种单链DNA缺口本身就是1个信号,可以指导在真核细胞中进行正确的错配校正。
七、拓扑异构酶
topoI可以在双螺旋DNA中的1条链上造成缺口,于是缺口两侧的DNA就能够以缺口对面的磷酸基团为中心自由旋转,旋转方向取决于DNA双螺旋中的张力,使张力得以释放。
E.coli的topoⅠ只作用于负超螺旋DNA,消除负超螺旋,它对正超螺旋DNA不起作用。
而真核细胞的topoI能够使正或负超螺旋都消除。
topoⅡ可以同时共价结合于DNA的两条链,并将两条链暂时切断,再重新连接。
在复制叉前进时,E.coli的topoⅡ可以将前方产生的正超螺旋转变为负超螺旋。
此外,它还能在DNA双螺旋中引入负超螺旋,
在E.coli中还有1种第二类DNA拓扑异构酶——topoⅣ,它的功能是将复制产生的两个子染色体从连环体(catenanes)中分离出来。
所有的第二类DNA拓扑异构酶都催化连环(catenation)和去连环(decatenation)过程
第二节DNA的损伤修复
环境的物理或化学因素给细胞中的DNA带来的损伤有以下几种类型:
(一)碱基丢失
(二)碱基改变(三)核苷酸插入或缺失(四)DNA链断裂(五)DNA链间共价交联。
二、DNA损伤的几种修复机制
(一)直接修复(directrepair)
(二)切除修复(excisionrepair)(三)重组修复(recombinationalrepair)(四)DNA的倾向差错合成和SOS反应
切除修复可以分为以下3种方式:
①碱基切除修复。
②核苷酸切除修复。
⑧碱基错配修复(校正),
第三节逆转录
----所谓逆转录,是指在逆转录酶的作用下以RNA为模板合成DNA的过程。
逆转录酶兼有三种酶的活性:
RNA指导的DNA聚合酶,DNA指导的RNA聚合酶和RNaseH活性。
-----转化(transformation)是指真核细胞被转变为无限增生状态(类似于癌变细胞),或者原核细胞获得新的遗传标记的过程。
-----逆转录病毒获得和转移真核细胞DNA序列的过程叫作转导(transduction),转导这一概念也适用于通过噬菌体将细菌基因从1个细菌细胞转移给另1个细胞。
第十三章RNA的生物合成
以DNA为模板合成RNA的过程叫作转录(transcription)。
-----在DNA双链中,起转录模板作用的链叫作模板链(templatestrand)或负链。
而另l条非转录模板链通常称为编码链(codingstrand)或正链,因为其序列和转录产物相同(仅T替代U)。
RNA聚合酶结合于DNA特异的启动子(promoter)。
DNA中转录合成RNA的第一个碱基对,这个位点的核苷酸残基编号为+1。
某些启动子的转录起点不是固定的,而是选择性出现于相邻的两个或三个碱基对中。
RNA聚合酶合成RNA的方向为5´
→3´
,,所以从转录起点沿RNA聚合酶运动的方向称为下游(downstream),核苷酸残基编号依次为+2,+3……,而反方向为上游(up—stream),核苷酸残基编号为-1,-2……。
------从启动子到终止序列(terminatorsequence)之间的DNA序列叫作转录单位(transcriptionunit)。
第一节原核基因的转录起始
-------操纵子(operon),即1个启动子控制连在一起的多个结构基因的转录。
一、RNA聚合酶和启动子
细菌细胞中只有1种RNA聚合酶,它兼有合成mRNA、tRNA和rRNA的功能。
E.coli细胞中的RNA聚合酶有几种形式,其主要形式由5个亚基组成
σ亚基是细菌基因的转录起始因子,它识别并结合于启动子,一旦转录开始就离开RNA聚合酶,代之以延伸因子结合于RNA聚合酶的核心酶(coreenzyme)。
E.coli的RNA聚合酶全酶中最常见的σ因子是σ70,
α亚基二聚体的结合位点处于启动子靠近上游的调节序列,它和转录频率(即启动子的强弱)直接相关。
β´
亚基主要结合于DNA的转录模板链,而β亚基则结合底物NTP,并催化形成磷酸二酯键。
RNA聚合酶催化的RNA合成主要分为3个阶段:
起始、延伸和终止。
***RNA聚合酶的功能包括:
①寻找转录起点,即E.coli墓因组中的大约2000个启动子。
②解开一小段DNA双螺旋,以便产生单链DNA转录模板。
⑧选择正确的底物NTP,并催化合成磷酸二酯键。
④识别转录终止信号。
⑤和转录激活蛋白或阻遏蛋白相互作用,以调节转录速度,这是基因表达调控的主要步骤。
和DNA聚合酶的活性相比,RNA聚合酶没有核酸外切酶活性,也就不具备校正和修复功能。
所以,RNA能够从头合成,不需要引物,转录的忠实性自然比复制低得多,其误差率为10-4一10-5,比DNA复制的误差要高105倍。
-----启动子是一段DNA序列,它是RNA聚合酶结合并起始转录的位点。
E.coli操纵子的启动子序列,以-35和-10为中心存在共有序列
a启动子有强弱之分,即不同的启动子转录合成RNA的频率有高有低。
启动子的强弱很大程度上取决于启动子的序列和RNA聚合酶之间的亲和力。
a强启动子除了必须具备-10和-35区共有序列以外,RNA聚合酶的α亚基和-40~-60区的启动子调节序列相互作用也十分重要。
********转录的起始
(一)转录始于DNA模板的一定区域。
首先,RNA聚合酶和DNA形成封闭式复合物(closecomplex),σ70因子紧紧结合于启动子序列,DNA双链仍保持碱基配对。
(二)RNA聚合酶一旦结合于启动子,就催化双链DNA解旋,并打开约17bp的区域(约合B型DNAl.6圈),形成开放式复合物(opencomplex)。
这样,在DNA转录区产生了局部单链的转录“泡”(bubble),暴露出复制模板链,使NTP(底物)能够与其相应的碱基(模板)配对。
(三)接着,RNA聚合酶沿转录模板链运动(DNA3´
→5´
),转录泡随之移动,同时以NTP为底物按5´
方向合成RNA链,使之互补于模板DNA链。
转录不需要引物,RNA可以从头合成,新合成的RNA链的5´
端核苷酸是高度特异的,为pppG或pppA。
。
(四)当大约10个核苷酸已经聚合以后,RNA聚合酶释放σ因子,代之以延伸因子结合于核心酶并继续转录。
(五)操纵子的转录调节主要通过阻遏蛋白和激活蛋白。
阻遏蛋白结合于操纵基因(operator),抑制了RNA聚合酶的转录起始。
而激活蛋白和RNA聚合酶接触并促进转录起始。
(六)细菌经常利用不同的可互换的σ亚基,以识别特殊的启动子,并调节基因的开关。
在迄今所研究的所有真核细胞核中都含有三种RNA聚合酶。
其中,RNA聚合酶I主要合成rRNA,RNA聚合酶Ⅱ主要合成mRNA,而RNA聚合酶Ⅲ的转录产物主要是tRNA和5SrRNA.
在真核基因转录起始阶段,识别真核基因的启动子序列,起主要作用的通常是蛋白因子,而不是RNA聚合酶本身。
绝大多数RNA聚合酶I和Ⅱ的启动子位于转录起点的上游,而某些RNA聚合酶Ⅲ的启动子位于转录起点下游。
和RNA聚合酶Ⅱ转录有关的蛋白因子数目众多,可大致分为以下三种类型:
(一)通用(或基本)转录因子(generalorbasalfactors)
(二)上游因子(upstreamfactors)(三)可诱导因子(induciblefactors)
------可诱导因子(如热休克转录因子HSTF)结合的DNA序列叫作效应元件或应答元件(responseelements).
-------如果1个基因的转录调节区的元件仅仅被基本因子和上游因子所识别和结合,它就应当在任何类型的细胞中转录。
这种基因可能是组成性表达基因(即管家基因,housekeepinggenes),
------增强子(enhancer)序列可以远距离(±
50Kb)增强转录起始,其位点在转录起点上游或下游均可,且与本身序列的方向无关。
增强子通常和组织特异表达或时间调节表达的基因转录有关。
--------转录因子的定义是,转录起始所需要的非RNA聚合酶本身组分的任何蛋白。
很多转录因子通过识别顺式作用位点启动子和增强子而起作用,但并非所有的转录因子都结合于DNA,某些转录因子还可能识别并结合于其他因子或RNA聚合酶,也可能在其他几种蛋白因子存在时参与组成转录起始复合物。
真核基因转录调节的共同模式是以正调节为主对启动子进行特异的抑制性调节(负调节)的例子不多。
第三节调节真核基因转录的顺式作用元件
一、基因调控区
基因调控区主要由两种序列组成:
一是启动子,即转录因子和RNA聚合酶结合区,它们组装成转录复合物;
二是调节序列(regulatorysequences),即基因调节蛋白结合区,它们调节转录复合物的组装及转录速度。
RNA聚合酶Ⅱ的启动子由以下两个区域组成:
①核心启动子(corepromoter)包括TATA盒和起始子(initiator,Inr),结合基本转录因子,形成起始复合物。
②启动子近侧序列元件(PSE),GC盒、CAAT盒和OCT(1L聚体)等短序列元件,结合上游因子和可诱导因子,决定启动子的转录效率和特异性。
-----TATA盒,位于转录起始位点上游大约25~35bp,由6个非常保守的碱基TATA(A/T)A组成,TATA盒对转录起点定位起关键作用。
------Inr位于转录起点附近。
绝大多数Inr在一1和十1两个位点的核苷酸序列为CA。
Inr对于转录始于固定位点也起关键作用。
TBP是TATA盒和Inr的通用转录因子,而TFII-I结合于Inr。
--------真核基因转录起点核心启动子上游100~200bp范围内有1个转录调控区,叫作启动子近侧元件(promoterproximalsequenceelements,PSE),这些元件常常表现出细胞类型特异性。
转录起点上游100bp的启动子区域中,对转录有影响的三个短序列元件中心分别位于-30、-75、-90。
这三个元件分别是TATA盒(-30),CAAT盒(-75)和GC盒(-90)。
------CAAT盒一般位于-80附近。
CAAT盒的1个特点是它的功能和方向无关。
CAAT盒加强转录效率。
GC盒也是比较常见的PSE元件,经常以多拷贝出现,其共有序列为GGGCGG,它的功能也和序列方向无关。
常见的PSE元件还有核苷酸八聚体(Octamer,OCT)。
这个8bp长的序列元件以不同的拷贝数、不同的位置和不同的方向出现于许多真核基因启动子中。
TATA盒和Inr主要决定转录起点的位置,它们只能引起相当低水平的转录。
而PSE元件则影响转录起始的频率。
真核基因几个PSE元件之间的序列并不重要,改变10~30bp距离通常不会影响其功能,但不能超过一定限度。
RNA聚合酶I的启动子包括两个组成部分:
一是核心启动子(-45~+20),它决定转录起始。
二是上游调控元件(upstreamcontrolelement,UCE),位于-180~-107,它决定转录效率。
RNA聚合酶Ⅲ的启动子分为两大类,第一类是内部启动子(internalpromoter),负责转录5SrRNA和tRNA的基因,它们位于转录起点的下游。
第二类启动子位于转录起点的上游,其转录产物是参与RNA前体剪接的snRNA(U6)等,它的转录方式在真核基因中较为常见。
TBP(TATA盒结合蛋白)是所有三种真核RNA聚合酶通用的转录起始因子。
第四节RNA聚合酶Ⅱ转录起始复合物
一、通用转录因子和转录起始复合物的组装
RNA聚合酶Ⅱ的转录起始因子属于通用转录因子(或基本转录因子),其中,TFIID由1个TATA盒结合蛋白(TBP)和8个以上TBP结合因子(TAF2)组成。
TBP和其他DNA结合蛋白的主要区别在于,它和DNA双螺旋的接触部位主要在小沟(minorgroove),并且使DNA分子发生明显弯曲(约900)。
首先,TFIID结合于启动子中的TATA盒,随后,TFIIB、RNA聚合酶Ⅱ-TFIIF、TFIIE、TFIIH和TFIIJ按顺序先后加入并最终形成转录起始复合物,转录才可能开始。
RNA聚合酶Ⅱ转录起始需要水解ATP以产生能量,这一点和RNA聚合酶I和Ⅲ的转录起始不同。
二、转录因子的功能性结构域
真核转录激活蛋白的结构模型是,1个或多个激活结构域通过有一定柔性的结构域,连结于特异的DNA结合结构域。
由于连接两个功能结构域之间的肽段具有一定的柔性,所以改变这些肽段长度,或者改变真核基因调控区的序列元件之间的距离,不一定影响转录因子的作用。
三、DNA结合结构域
真核转录因子的DNA结合结构域具有多种结构motif(或结构域亚单位),有五种类型最常见的转录因子的DNA结合结构域,它们是同源盒结构域蛋白,即HD蛋白(homeodomainproteins),锌指蛋白(zinc-fingerproteins)、翼状螺旋蛋白(Winged-helixproteins)、亮氨酸拉链蛋白(1eucine-zipperproteins)和螺旋—环—螺旋蛋白(helix-loop-helixproteins,即HLH)。
第七节转录终止
一、原核基因的转录终止
E.coli有两种基本的转录终止机制。
1种机制不需要其他蛋白因子参与,而另1种则依赖于1种蛋白因子——转录终止因子Rho。
二、真核基因的转录终止
真核基因转录终止的机理尚知之甚少。
RNA聚合酶Ⅲ转录终止于合成了一系列U之后,但并不需要上游出现茎环结构。
在绝大多数哺乳动物转录单位中,RNA聚合酶Ⅱ转录终止于polyA加成位点(additionsite)下游0.5~2Kb范围内的多个可能位点。
第一章蛋白质的结构与功能
一级结构:
指多肽链中氨基酸的排列顺序,即它的化学结构。
二级结构:
指借助主链(不包括侧链)的氢键形成的具有周期性的构象。
三级结构:
指1条肽链(包括主链和侧链)完整折叠而形成的构象。
四级结构:
指含有多条肽链的寡聚蛋白质分子中各亚基间相互作用,形成的构象。
超二级结构和结构域是在蛋白质二级和三级结构之间的两个层次。
超二级结构:
指相邻的二级结构单元,在侧链基团次级键的作用下彼此靠近而形成的规则的聚集结构。
结构域:
指在1条肽链内折叠成的局部结构紧密的区域。
组成四级结构的多肽链称为蛋白质的亚基,多个亚基组成的蛋白质为寡聚蛋白质
1维持蛋白质分子构象的作用力,主要包括氢键、疏水性相互作用、范德华引力、离子键和二硫键。
2二级结构主要包括下面几种基本类型
(一)α—螺旋
(二)β折叠(三)转角(四)β突起(五)卷曲(六)无序结构
3β折叠有两种类型,1种是平行式,1种是反平行式。
反平行折叠在能量上更稳定。
4转角主要分两类:
β转角和γ转角。
转角结构通常负责各种二级结构单元之间的连接作用。
5常见的3种超二级结构单元为:
ααββ,βαβ。
6结构域不仅仅是折叠单位和有一定功能的结构单位,还是一个遗传单位
7结构域可以分为4种类型:
反平行α,平行α/β,反平行β,不规则的小结构
1、多肽链的折叠过程
天然蛋白质是多肽链合成后经折叠而形成的热力学上稳定的构象。
多肽链的折叠是一自发过程..人们现已提出了一些多肽链的折叠模型,大致可以分为二类。
一种模型认为多肽链的折叠是逐步进行的,先形成一种稳定的二级结构作为核心,然后二级结构的氨基酸侧链进一步发生交互作用,扩大成天然三维结构;
另一种模型提出,多肽链可能由于其疏水侧链的疏水交互作用而突然自发折叠,形成一种含二级结构的紧密状态,最后调整成天然结构。
这两种模型看来不是排斥的,有些多肽链的折叠可能以其中之一为主,有些多肽链的折叠兼而有之。
在这两种情况下,超二级结构的形成都可能起着导引作用,弱键则做最后的热力学上的调整。
活体内至少有两类蛋白质因子参与了多肽链的折叠,一类蛋白质称为分子伴侣(molecularchaperone)。
这些蛋白质中,有些能结合于多肽链以防上侧链间的非专一性缔合,它们导引一些多肽链的折叠和使多个多肽链聚集成更大的结构;
另一类蛋白质是酶,它们能通过解除限制折叠的因素来促进多肽链的折叠。
蛋白质分子结构与功能的关系
一、蛋白质的一级结构决定高级结构
(一)蛋白酶原的激活
生物体中有许多蛋白质是以无活性的蛋白质原的形式在体内合成分泌的。
这些肽链只有以特定的方式断裂后,才呈现出它的生物学活性。
这类
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