第四章酶学分析技术.ppt
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1第四章酶学分析技术酶学分析技术2酶(酶(enzymeenzyme)的本质:
)的本质:
高度特异性、高度不稳定性,高效性、可调节性高度特异性、高度不稳定性,高效性、可调节性酶的应用:
酶的应用:
由活细胞产生的能高效催化特异生化反应的蛋白质,属于生物催化剂由活细胞产生的能高效催化特异生化反应的蛋白质,属于生物催化剂酶的特点:
酶的特点:
酶活性的检测、代谢物的酶学分析和同工酶及亚型测定用于临酶活性的检测、代谢物的酶学分析和同工酶及亚型测定用于临床诊断和疗效判断床诊断和疗效判断3主要内容:
主要内容:
l酶活性测定的基本知识酶活性测定的基本知识l酶活性单位的计算与校准酶活性单位的计算与校准l酶活性的测定酶活性的测定l代谢物的酶法检测代谢物的酶法检测l同工酶测定同工酶测定4l掌握掌握酶活性单位的表示方法与计算、酶活性测定的酶活性单位的表示方法与计算、酶活性测定的定时法与连续监测法、代谢物的酶法测定。
定时法与连续监测法、代谢物的酶法测定。
l熟悉熟悉酶促反应进程、酶促反应动力学、酶活性测定酶促反应进程、酶促反应动力学、酶活性测定的直接法与间接法、酶活性测定的影响因素。
的直接法与间接法、酶活性测定的影响因素。
l了解了解同工酶产生的机理与测定方法、酶活性单位的同工酶产生的机理与测定方法、酶活性单位的校准、工具酶的应用。
校准、工具酶的应用。
教学要求:
教学要求:
5第一节第一节酶活性测定的基本知识酶活性测定的基本知识酶测定酶测定绝对定量法(酶量直接测定法):
免疫学方法绝对定量法(酶量直接测定法):
免疫学方法相对定量法(酶活性间接测定法):
生化检测方法相对定量法(酶活性间接测定法):
生化检测方法EE6简介内容:
简介内容:
一、酶活性一、酶活性二、酶活性单位与酶活性浓度二、酶活性单位与酶活性浓度三、酶促反应进程三、酶促反应进程四、酶促反应动力学四、酶促反应动力学7一、酶活性一、酶活性n定义:
酶活性(定义:
酶活性(enzymeactivityenzymeactivity)也称为酶活力,指)也称为酶活力,指酶促反应速率,即规定条件下在单位时间内酶促反应速率,即规定条件下在单位时间内产物的生成产物的生成量量或底物的减少量。
或底物的减少量。
n表示方法:
表示方法:
或或式中式中vv:
反应速率,:
反应速率,PP:
产物浓度,:
产物浓度,tt:
时间,:
时间,SS:
底物浓度。
:
底物浓度。
8二、酶活性单位与酶活性浓度二、酶活性单位与酶活性浓度
(一)酶活性单位
(一)酶活性单位u定义:
表示酶的相对含量,指在一定条件下,定义:
表示酶的相对含量,指在一定条件下,单位时间内单位时间内生成一定量的产物或消耗一定量的底物所催化的酶量生成一定量的产物或消耗一定量的底物所催化的酶量。
u表示方法:
表示方法:
惯用单位(一定的反应量惯用单位(一定的反应量/一定的反应时间)一定的反应时间)国际单位国际单位IUIU(mol/minmol/min)KatalKatal单位(单位(mol/smol/s)911惯用单位:
惯用单位:
2020世纪世纪6060年代以前根据酶活性测定方法建立者的姓氏命名的单位年代以前根据酶活性测定方法建立者的姓氏命名的单位ALPALP的金氏单位(的金氏单位(KingKing)氨基移转酶的卡门氏单位(氨基移转酶的卡门氏单位(KarmenKarmen)特点:
各单位对温度、时间、物质量的定义不同,导致各测特点:
各单位对温度、时间、物质量的定义不同,导致各测定值、参考范围相差很大,彼此间无法比较定值、参考范围相差很大,彼此间无法比较,现在临床应用较现在临床应用较少。
少。
卡门氏单位:
卡门氏单位:
1.0ml1.0ml血清在血清在2525,340nm340nm,反应体积,反应体积3.0ml,3.0ml,光径光径1.0cm1.0cm时时每分钟测定吸光度下降每分钟测定吸光度下降0.0010.001,即消耗,即消耗4.824.821010-4molNADH-4molNADH为一个为一个卡门氏单位卡门氏单位举例:
举例:
金氏单位:
金氏单位:
100ml100ml血清血清ALPALP在在3737与底物作用与底物作用15min15min,产生,产生1mg1mg酚。
酚。
102.2.国际单位国际单位IUIU(mol/minmol/min)定义:
在规定条件下(定义:
在规定条件下(2525及其他最适条件),每及其他最适条件),每minmin催化催化11molmol底物转变为产物的酶量,为底物转变为产物的酶量,为1IU1IU或或1U1U,1IU=11IU=1mol/minmol/min。
IFCC,2001IFCC,2001年年373733KatalKatal单位单位定义:
定义:
1Katal1Katal是在规定条件下,每秒钟催化是在规定条件下,每秒钟催化1mol1mol底物转变为产物的底物转变为产物的酶量。
酶量。
1Katal1Katal1mol/s1mol/s。
IUIU与与KatalKatal单位的关系:
单位的关系:
1katal=601katal=60101066IUIU,1IU=16.67nkatal1IU=16.67nkatal11
(二)酶活性浓度
(二)酶活性浓度酶活性浓度指酶活性浓度指单位体积样本中的酶活性单位单位体积样本中的酶活性单位。
国际单位国际单位用用IU/LIU/L或或U/LU/L表示表示。
酶活性浓度才具有临床可比性,但其多数。
酶活性浓度才具有临床可比性,但其多数情况下都被不严格地称为酶活性单位乃至酶活性情况下都被不严格地称为酶活性单位乃至酶活性.12三、酶促反应进程三、酶促反应进程以以产物生成量(或反产物生成量(或反应物减少量)为纵坐标、应物减少量)为纵坐标、反应时间为横坐标反应时间为横坐标作图所作图所得到的一条曲线,称为反得到的一条曲线,称为反应进程曲线(或反应时间应进程曲线(或反应时间曲线、速率曲线、时间曲曲线、速率曲线、时间曲线)线)t1t2时间t图5-1酶促反应进程曲线吸光度A延滞期线性期非线性期13
(一)延滞期
(一)延滞期(lagphase、延迟期、延迟期)u特点:
为反应的初始阶段,反应速率一开始时较慢,通常为几秒到几分钟特点:
为反应的初始阶段,反应速率一开始时较慢,通常为几秒到几分钟t1t2时间t图5-1酶促反应进程曲线吸光度A线性期非线性期R1R2延滞期孵育期延滞期14
(二)线性期
(二)线性期此阶段酶促反应速率此阶段酶促反应速率基本保持恒定基本保持恒定;对底物而言,为反应速率与底物浓度对底物而言,为反应速率与底物浓度SS的零次方成正比的的零次方成正比的零级反应零级反应,即不受底物浓度的影响,而只与酶活性浓度成正比即不受底物浓度的影响,而只与酶活性浓度成正比;此时底物的消耗量小于此时底物的消耗量小于5%5%,反应速率,反应速率为反应初速率为反应初速率。
酶活性浓度越高,线性期就越短酶活性浓度越高,线性期就越短线性度:
判断线性期的一个指标,指吸光度(线性度:
判断线性期的一个指标,指吸光度(AA)相对于时间()相对于时间(minmin)变化的可以接受)变化的可以接受的程度的程度。
线性度线性度=前半段前半段A/minA/min后半段后半段A/minA/min/(前半段(前半段A/minA/min后半段后半段A/minA/min)/2/2100100线性度值越小则线性越好。
一般判断标准:
不大于线性度值越小则线性越好。
一般判断标准:
不大于1515,否则判为非线性,否则判为非线性u特点:
可代表酶促反应速度特点:
可代表酶促反应速度15(三)非线性期(三)非线性期(偏离线性期、平坦期偏离线性期、平坦期)u进入非线性期的原因:
进入非线性期的原因:
反应的不断进行,反应的不断进行,底物消耗越来越多,酶变性失活增加、可逆反底物消耗越来越多,酶变性失活增加、可逆反应增强、产物抑制增加应增强、产物抑制增加等使得反应速率明显下降。
等使得反应速率明显下降。
u特点:
特点:
若为单底物的反应,则此时反应速率与单底物浓度若为单底物的反应,则此时反应速率与单底物浓度SS的一次方的一次方成正比,为成正比,为一级反应一级反应。
16四、酶促反应动力学四、酶促反应动力学n研究内容:
研究内容:
研究研究酶促反应的速率酶促反应的速率及其及其各种影响因素各种影响因素(如底物浓度、(如底物浓度、酶活性浓度、温度、酶活性浓度、温度、pHpH、激活剂和抑制剂等)的科学、激活剂和抑制剂等)的科学指导指导选择底物种类、确定底物浓度,确定最适温度、最选择底物种类、确定底物浓度,确定最适温度、最适适pHpH、激活剂和抑制剂类型与含量、激活剂和抑制剂类型与含量等,从而准确测定酶活性等,从而准确测定酶活性或代谢物浓度。
或代谢物浓度。
n研究意义研究意义:
17
(一)酶促反应
(一)酶促反应u酶促反应式酶促反应式u米氏方程:
米氏方程:
K418
(二)
(二)Km的含义与意义的含义与意义11KKmm的含义的含义:
当当KKmm=S=S时,时,可见,可见KKmm值等于反应速率达到最大反应速率值等于反应速率达到最大反应速率VVmaxmax一半时的底物浓度。
一半时的底物浓度。
22KmKm的意义的意义KmKm是酶的一个是酶的一个特征性常数特征性常数(其他如等电点),(其他如等电点),KmKm的大小只与酶的性质有关的大小只与酶的性质有关反映反映酶对底物亲和力酶对底物亲和力的大小的大小选择酶的选择酶的最适底物最适底物或天然底物或天然底物计算不同底物浓度时的计算不同底物浓度时的反应程度反应程度鉴别鉴别酶的种类酶的种类判断判断可逆反应的速率可逆反应的速率判断酶偶联反应的判断酶偶联反应的限速反应限速反应计算计算工具酶的用量工具酶的用量19(三)(三)Vmax的含义的含义u定义:
定义:
VmaxVmax表示在一定酶量时的最大反应速率,即酶完全表示在一定酶量时的最大反应速率,即酶完全被底物所饱和时的反应速率,与酶活性浓度呈正比。
被底物所饱和时的反应速率,与酶活性浓度呈正比。
u应用:
计算酶的转换数(应用:
计算酶的转换数(TN,催化常数,催化常数Kcat)单位时间内每)单位时间内每个酶分子将底物分子转换成产物的最大值个酶分子将底物分子转换成产物的最大值。
计算公式为:
计算公式为:
(单位是单位是ss-1-1)计算时要保证酶的浓度单位与底物的浓度单位一致)计算时要保证酶的浓度单位与底物的浓度单位一致)20(四)(四)Km和和Vmax的测定的测定11、双倒数作图法:
、双倒数作图法:
纵轴截距截距为斜率斜率为横横轴截距截距为Linweaver-Burk作图法作图法21利用此图还可用于判断可逆性抑制反应的性质:
利用此图还可用于判断可逆性抑制反应的性质:
如竞争性抑制:
如竞争性抑制:
为表观为表观KKmmKmKm22第二节第二节酶活性单位的计算与校准酶活性单位的计算与校准一、酶活性单位的计算(掌握)一、酶活性单位的计算(掌握)二、酶活性单位的校准(了解)二、酶活性单位的校准(了解)内容简介:
内容简介:
23一、酶活性单位的计算一、酶活性单位的计算
(一)通用公式
(一)通用公式前提条件:
前提条件:
必须保证启始底物量充足(必须保证启始底物量充足(SSKmKm),使),使酶促反应处于零级反应期即线性期,反应初速率等于最酶促反应处于零级反应期即线性期,反应初速率等于最大反应速率,从而使酶发挥最大活性大反应速率,从而使酶发挥最大活性mumu与酶活性正与酶活性正相关,而与启始底物量无关相关,而与启始底物量无关24注释:
式中注释:
式中UU:
酶活性单位数,:
酶活性单位数,m0m0:
规定的产物生成量:
规定的产物生成量或底物消耗量,或底物消耗量,V0V0:
规定的样本体积,:
规定的样本体积,t0t0:
规定的反:
规定的反应时间,应时间,mumu:
实际产物生成量或底物消耗量,:
实际产物生成量或底物消耗量,VuVu:
实:
实际样本体积,际样本体积,tutu:
实际反应时间:
实际反应时间实测的酶活性大小规定的酶活性单位(5.1)25
(二)
(二)采用酶活性采用酶活性惯用单位的计算公式惯用单位的计算公式常用设立标准管(校准管)的对比法(简称
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- 第四 章酶学 分析 技术