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DNA合成酵素最早于1955年发现 

（DNA 

polymerase 

I）, 

而较具有实验价值及可得性的Klenow 

fragment 

E. 

Coli 

则是于70年代的初期由Dr. 

H. 

Klenow 

所发现, 

但由于这个酵素是一种易被热所破坏之酵素, 

因此不符合一连串的高温连锁反应所需。

现今所使用的酵素 

（简称 

Taq 

polymerase）, 

则是于1976年从热泉 

Hot 

spring中的细菌（Thermus 

Aquaticus） 

分离出来的。

它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酵素，但它被广泛运用则于80年代之后。

PCR的原始雏形概念是类似基因修复复制 

repair 

replication），它是于1971年由 

Dr. 

Kjell 

Kleppe 

提出。

他发表第一个单纯且短暂性基因复制 

（类似PCR前两个周期反应） 

的实验。

而现今所发展出来的PCR则于1983由 

Kary 

B. 

Mullis发展出的，Dr. 

Mullis当年服务于一家物科技研究公司 

（Perkin-Elmer 

Cetus 

Corporation）. 

目前这家公司在PCR的相关仪器及原料上占有很大的巿场。

Dr.Mullis 

并于1985年与 

Saiki 

等人正式表了第一篇相关的论文。

此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。

在 

1989 

年，Science 

将PCR中的DNA合成酵素命名为当年的风云分子 

（Molecule 

the 

year），而PCR本身则列为年度的重要科学发明产物。

当然，它的原发明者更在往后获得诺贝尔的桂冠。

PCR影响因素 

PCR是非常直接、简单又具有强大威力的技术。

诚如一位当年参与PCR诞生的资深研究员Henry 

Erlich所言”在分子生物学的领域中，只要拥有它，你便可以无照营业”（PCR 

allows 

people 

to 

practice 

molecular 

biology 

without 

a 

liscence）。

也因此，活用及慎用PCR是确保一定品质的必要条件。

PCR本身虽然是一个单纯的实验技术，但是一个好的PCR反应及其产物则是受到很多因素的影响。

这些因素色括反应中各种原料的浓度 

Polymerase, 

dNTPs, 

MgCl2…），也包括整个反应中各步骤的温度与时间的设定。

当然DNA模板（Template） 

与 

引物 

（Primers） 

本身条件也占有一定的重要性。

近来的观念中，共溶剂诸如 

Dimethyl 

sulfoxide 

（DSMO）、glycerol、Foramide 

Tetramethylammonium 

chloride 

（TMAC） 

也对整个反应产生若干重要的影响。

PCR应用

PCR除了是一个诊断工具外，更重要的是它有广泛的运用。

PCR本身可直接用来鉴定特定基因的存在与否，也可以用来侦测基因是否有异常 

（Gene 

mutation, 

deletion, 

rearrangement…）。

例如，在医学上对遗传疾病或肿瘤癌症的诊断及预后的评估；

对细菌、病毒及霉菌感染的诊断。

它也可成为一个生产线进而大量复制特定的基因进行基因密码的读取 

sequencing） 

及其它的运用。

举凡对生物标本及法医学上的样本鉴定，从单一毛发、一只精虫或一滴血液、唾液来找出凶手。

也可以做DNA指纹 

（Fingerprints） 

比对帮助亲子关系的鉴定。

PCR更可以用于器官移植组织兼容性HLA的分析。

另外在演化上的分析，经由PCR的运用也产生重大的进展。

近来，在生物医学的研究上，特别是细胞间讯息的传递分子，诸如介白质 

（Interleukines） 

及各种生长因子 

（Growth 

factors） 

基因的表现都可用PCR来进行质与量的分析。

PCR产物的电泳检测时间

　　一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。

假阴性，不出现扩增条带

　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。

寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

　　模板：

①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

⑤模板核酸变性不彻底。

在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

　　酶失活：

需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。

需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

　　引物：

引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。

有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：

①选定一个好的引物合成单位。

②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。

如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。

④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

　　Mg2+浓度：

Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

　　反应体积的改变：

通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。

或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

　　物理原因：

变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;

退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。

有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。

　　靶序列变异：

如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

假阳性

　　出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

　　引物设计不合适：

选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。

靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。

需重新设计引物。

　　靶序列或扩增产物的交叉污染：

这种污染有两种原因：

一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。

这种假阳性可用以下方法解决：

操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。

所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。

必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。

二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。

可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

出现非特异性扩增带

　　PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

非特异性条带的出现，其原因：

一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。

二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。

其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

其对策有：

必要时重新设计引物。

减低酶量或调换另一来源的酶。

降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。

适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。

出现片状拖带或涂抹带

　　PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。

其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。

减少酶量，或调换另一来源的酶。

②减少dNTP的浓度。

适当降低Mg2+浓度。

增加模板量，减少循环次数。

克隆PCR产物

1）克隆PCR产物的最优条件是什么？

最佳插入片段：

载体比需实验确定。

1：

1（插入片段：

载体）常为最佳比，摩尔数比1：

8或8：

1也行。

应测定比值范围。

连接用5ul2X连接液,50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。

室温保温1小时，或4℃过夜。

在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。

室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4℃过夜。

2）PCR产物是否需要用凝胶纯化？

如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。

如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。

少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。

为此需在克隆前做凝胶纯化。

3）如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？

A）涂布未转化的感受态细胞。

如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。

B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。

例如，将1ug/ul质粒1:

100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。

用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。

培养过夜，产生1000个菌落。

转化率为：

产生菌落的总数/铺板DNA的总量。

铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。

具体而言转化用10ngDNA，用SOC稀释到1000u后含10ngDNA，用1/10铺板，共用1ngDNA。

1000克隆X10（3次方）ng/铺板1ngDNAug=10（6次方）cfu/ug

转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ug感受态细胞

如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。

C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生>

20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ug感受态细胞），表明载体失去T。

可能是连接酶污染了核酸酶。

T4DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4DNA连接酶替换。

D）用pGEM-T或pGEM-TEasy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生>

20-40蓝斑,没有菌落或少有菌落，连接有问题。

4）对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？

A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4℃过夜。

B）插入片段带有污染，使3`-T缺失，或抑制连接，抑制转化。

为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。

如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。

如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-TEasy载体3`-T缺失。

C）插入片段不适于连接。

用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。

UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。

D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-TEasy载体克隆所需。

加TaqDNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。

详情查pGEM-TpGEM-TEasy载体技术资料（TM042）。

E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞

PCR反应体系与反应条件

标准的PCR反应体系：

　　　　　　10×

扩增缓冲液　10ul

　　　　　　4种dNTP混合物　各200umol/L

　　　　　　引物　　　　　各10～100pmol　

　　　　　　模板DNA　　　　0.1～2ug　

　　　　　　TaqDNA聚合酶　2.5u　

　　　　　　Mg2+　　　　　　1.5mmol/L

　　　　　　加双或三蒸水至　100ul

　　PCR反应五要素：

参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。

理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

设计引物应遵循以下原则：

①引物长度：

15-30bp，常用为20bp左右。

②引物扩增跨度：

以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基：

G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。

ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'

端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

⑤引物3'

端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性：

引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

引物量：

每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

8．一般原则：

长度15－30bp，Tm=GC*4+AT*2,碱基分布随机，GC的含量在45％－55％左右，两个引物在3‘端决不能有任何的修饰，不能出现同源性，否则会形成二聚体，引物3‘端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，GC居其中间，所以3’端最好选择T

9．DNA的扩增的兼并引物设计：

选择扩增的AA序列，必须事先进行试验，因为遗传密码有兼并性的问题，引物最好选择转译的密码子，如肽的序列已知位于羟基的终端，翻译终止密码也能使用，引物为15－20bp，兼并性不要大于516，避免兼并引物在3‘端出现

酶及其浓度　目前有两种TaqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。

催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100ul时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

　　dNTP的质量与浓度　dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。

dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris。

HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。

多次冻融会使dNTP降解。

在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。

浓度过低又会降低PCR产物的产量。

dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

　　模板（靶基因）核酸　模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。

SDS的主要功能是：

溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；

蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。

提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。

一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。

RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

　　Mg2+浓度　Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。

Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

　　PCR反应条件的选择

　　PCR反应条件为温度、时间和循环次数。

　　温度与时间的设置：

基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。

在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。

对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸（此温度TaqDNA酶仍有较高的催化活性）。

　　①变性温度与时间：

变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。

一般情况下，93℃～94℃min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。

此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。

　　②退火（复性）温度与时间：

退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。

变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。

由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。

退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。

对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。

引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：

　　　　　Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T）

　　　　　复性温度=Tm值-（5～10℃）

　　在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。

复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。

　　③延伸温度与时间：

TaqDNA聚合酶的生物学活性：

　　　　　　　　　70～80℃150核苷酸/S/酶分子

　　　　　　　　　70℃60核苷酸/S/酶分子

　　　　　　　　　55℃24核苷酸/S/酶分子

　　　　　　　　　高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。

　　PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。

PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。

3～4kb的靶序列需3～4min；

扩增10Kb需延伸至15min。

延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。

对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

PCR污染及解决对策 

PCR检测微量感染因子时，一定要注意产物残留污染的问题。

一． 

污染的预防

进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。

（一）划分操作区：

目前，普通PCR尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求实验操作在三个不同的区域内进行，PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行：

1. 

标本处理区，包括扩增摸板的制备；

2. 

PCR扩增区，包括反应液的配制和PCR扩增；

3. 

产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。

各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。

如：

标本制备→PCR扩增→产物分析→产物处理。

切记：

产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。

（二）分装试剂：

PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。

所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源的DNA：

1． 

PCR用水应为高压的双蒸水；

2． 

引物和dNTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产物区配制；

3． 

引物和dNTP应分装储存，分装时应标明时间，以备发生污染时查找原因。

（三） 

实验操作注意事项 

尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。

因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：

戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套；

使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；

避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。

若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；

4. 

操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度；

5. 

最后加入反应模板，加入后盖紧反应管；

6. 

操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性；

7. 

尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。

如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区；

8. 

重复实验，验证结果，慎下结论。

二． 

追踪污染源

如果不慎发生污染情况，应从下面几条出发，逐一分析，排除污染。

（一）设立阴阳性对照：

有利于监测反应体系各成分的污染情况。

选择阳性对照时，应选择扩增弱，且重复性好的样品，因强阳性对照可产生大量不必要的扩增序列，反而可能成为潜在的污染源。

如果以含靶序列的重组质粒为对照，100个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增。

阴性对照的选择亦要慎重，因为PCR敏感性极高，可以从其它方法（Sourthern 

印迹或点杂交等）检测阴性的标本中检测出极微量的靶分子。

此外，每次扩增均应包括PCR体系中各试剂的时机对照，即包括PCR反应所需的全部成分，而不加模板D