水稻遗传转化体系ProtocolWord文档格式.docx
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三、继代
掐芽后7天左右,进行第一次继代,用镊子将新长出的愈伤夹成小块(17),
转入新的NB培养基中,每皿20粒,在27度恒温箱中暗培养15天后进行第二次继代,培养15天后,就可以长出颜色鲜黄,表面光滑,直径大小为2-3mm的胚性愈伤组织颗粒。
大小合适的愈伤可以进行预培养,小的就进行第三次继代。
四、农杆菌介导的水稻遗传转化
共培养(整个操作过程需8天)
第一天:
选取自然分散,颜色鲜黄,直径约为2-3mm的颗粒愈伤,置于27度暗培养4天。
第三天:
农杆菌划线28°
培养,两天后农杆菌长满即可洗脱(18),用于转化。
第五天:
悬浮农杆菌,悬浮于添加有100uM乙酰丁香酮(AS)(19)20ML的AMM液体培养基(20)中,剧烈震荡1min后,静置1h,让农杆菌形成悬浮液,取菌液于三角瓶中加入经预培养的愈伤,略微摇动静置30min,于无菌纸上晾干愈伤后置于添加有100uM的乙酰丁香酮的NB培养基(AS培养基(21)上27度暗培养3天。
第八天:
等农杆菌生长至可见的愈伤下的菌斑,但未长满愈伤时,挑取愈伤于无菌培养瓶中,用无菌水冲洗,直至无可见菌丝为止,最后用含300mg/l的羧苄无菌水静置1h,置于无均滤纸上晾干后,转移至筛选培养基上。
五、抗性愈伤的继代筛选
当抗性愈伤在朝霉素30培养基(22)上生长15天后(23),将愈伤换到新的朝霉素30培养基上,15天后可观察到一些褐化愈伤开始长出的新的愈伤,继续培养,等新愈伤长出很多时转移至朝霉素50培养基(24)上,筛选3-7天。
六、分化
从朝霉素50培养基中将继续增生分裂的抗性愈伤转入分化培养基(25)上再生,成团而不是分散放置(26),一周后愈伤开始转绿,三周后开始长出幼芽,随后根也长出,当芽长至2-3cm时,就可移至1/2MS培养基(生根培养基)上(27)。
分化间进行,25°
(28),光14小时,暗10小时。
七、生根
超净工作台内进行,每个培养瓶中只放一个抗性愈伤诱导出来的苗(29),在生根培养基上生长10天。
(30)分化间进行,25°
,光14小时,暗10小时。
八、炼苗
生根十天后开盖,加已晾两天或晒过的水,泡过培养基即可(28),2天后
28)用水洗掉生根培养基,加晾两天或晒过的水浸过根,3-7天后待生长状态好了后移栽大田。
(期间每天要加水,确保根都泡在水中)。
分化间进行,25°
,光14小时,暗10小时。
九、移栽大田
土、水提前晒上两天,移栽盆装4/5体积的土,用水浸透即可,不能太多水,刚好浸过土面最好。
移栽:
在盆上标记好,盆宽移栽两株,长四株;
移栽时不能插深,植株能站住即可。
10天后可以施一点肥,不能太多。
20天后可以每10天施肥一次,同样不能太多,太多会烧苗(如烧苗,施肥3天后可以观察到,应马上将水换掉)。
要保证白天29°
(30),晚上23°
;
光14小时,暗10小时。
(31)
Notes
(1)不用一粒一粒用手拨皮,在桌上垫一些白纸,用书压。
力道要掌握好,太用力把种子压碎了,用力不够只能去个别的种皮,效率低。
注意:
接触种子的纸必须是全白色的,不能有印刷有子的,否则用力压时,墨就着黑色上种子。
(2)不正常的种子,一律丢弃。
因为后期若是一粒种子长菌的话就污染了整盘。
(3)a.20ml2%的NaClO的配制:
实验室买的是有效浓9%的NaCIO,所以取4.5ml9%的NaCIO力卩16ml蒸馏水即配成2%的NaClO
b.2%的NaClO现用现配,因为NaClO见光分解,所以配了就要赶紧用。
(4)20粒共三圈,外圈12粒,中圈7粒,里一粒。
(5)NB培养基的配置(800ml):
实验准备:
所有玻璃仪器必须洗净再用双蒸水润洗步骤:
取一升二角瓶f加24g蔗糖
依次加入80mlN6max(10X)⑹
16ml铁盐(50X)⑺
8ml肌醇(100X)(8)
4mlB5miin(200X)(9)
加多点(勿超500)三蒸水摇使其溶解,倒入1升量筒中,再加三蒸水定容至
780ml
J此时PH应为4.2-4.3
PH调至5.8(用pH计,KOH调)
加2.1g植物凝胶(10)
高压灭菌(121°
20min)
J灭完前30min,拿出16ml有机,化为液态
加1.6ml2.4-D(1mg/ml)(11)至16ml有机(12)中
待培养基稍烫手抽滤(13),倒培养基(14)
⑹N6max(10X)的配制(配1L):
①KNO328.3g
4.0g
4.63g
1.85g
1.66g或Cacl21.25g
②KH2PO4
@(NH4)2SO4
4MgSO47H2O
5Cacl22H2O
注:
a•①②③④一起溶解混匀成A,
b•⑤单独溶解,再与A交替混匀,以免长期存放产生沉淀;
c.4C冰箱保存;
(7)铁盐(50X)的配制(配500mL):
1FeSO47H2O0.695gg
2NA2EDTA2H2O0.9325g
a.①②分别溶解,再交替混匀,边加边摇匀;
b•棕色瓶装;
(8)肌醇(100X)的配制(配1L):
10g肌醇(InositoI)用双蒸水定容至1L;
4C冰箱保存;
(9)B5miin(200X)的配制(
配500mL):
①MnSO4.H2O
0.758g
②H3BO3
0.3g
③ZnS047H2O
0.2g
④CuSO45H2O
0.0025g
⑤CoCI26H2O
⑥KI
0.075g
⑦NaMoO42H2O
0.025g
a.一起溶解,二蒸水疋容至
500mL;
c.4C冰箱保存;
(10)非琼脂粉。
(11)2,4-D(1mg/mI)配1100mI):
加1ml无水乙醇用枪吸吹,可溶解。
再用纯水定容至100ml;
4C冰箱保存;
(12)有机(50X)的配制(配1L):
①盐酸硫胺素(VB1)
0.5g
②盐酸吡哆醇(VB6)
0.05g
③尼克酸(烟酸)
④水解酪蛋白
15g
⑤谷氨酰胺
12.5g
⑥脯氨酸
25g
⑦甘氨酸
0.1g
a.以上药品均要求Sigma的,一起溶解,三蒸水定容至1L;
b•再分装,每个16mL;
c.用滤纸、漏斗过滤分装;
d.-20°
冰箱保存;
e.用时提前拿出来;
(13)抽滤:
在超净台中把有机倒入一培养皿中,抽滤(先要试下过滤膜有没有装好:
注射器抽一些有机并抽入些空气,打出有机,若弹起,才可以进行抽滤。
所以通常过滤的应多准备几个;
若使用一次性过滤器则直接抽滤即可;
过滤膜为0.2um),摇荡三角瓶(混匀),酒精灯烧瓶口再倒培养基。
(14)倒培养基:
a.六皿培养皿一摞,从下至上倒培养基
b.每皿倒一半稍多厚(水稻组培要厚点),800ml倒22皿左右
C.快停时右手使三角瓶前倾点(可防倒到皿壁上)
d•移动培养皿摞时小心,慢点。
倒培养基后处理:
a.—升三角瓶、有机瓶子:
即刻冲洗。
b.过滤器:
过滤膜扔掉,冲洗过滤器(特别是过滤孔),打开晾干;
若是一次
性过滤器则不必;
c.注射器:
抽开晾干。
每次要用培养基提前2天倒好(保证无菌);
(15)要做到每天观察,一但发现有污染的要及时处理:
长真菌的话整盘丢弃,但长细菌的可以将未污染的转移到新的培养基上。
16)左手镊子轻夹愈伤,右手镊子掐芽,为掐而非拔。
17)发黑的愈伤不要,黏糊的不要,要的是偏硬的愈伤。
18)经验:
一般晚上划线,第三天上午做侵染。
(例:
1.1晚上划线,1.3号上午做侵染,所以1号、2号用来做实验准备,高压滤纸培养皿,100ml三角瓶、枪头等。
)
(19)AS的配制:
9.81mgAS用ImIDMSO溶解即可;
一般称98.1mg,用lOmIDMSO溶解,用1.5ml离心管分装,每管装1ml;
-20°
保存;
(20)AMM液体培养基的配制
(21)AS培养基(共培养培养基)的配制(8OOmI):
(22)筛选培养基I(Hyg30)的配制(800ml):
780mlNB+16ml有机+1.6ml2mgL-12,4-D+2ml100mg/mlCb+480ul
50mg/mlHyg
a.100mg/mlCb母液配制:
1gCB用10ml双蒸水溶解(应为略黄色、澄清、
有刺激性味液体),4C保存
b.50mg/mlHyg:
默克牌的买来就应该是这个浓度,即1g/20ml
c.Hyg30:
是指潮霉素浓度为30mg/ml(即:
480ulX1g/20mg-800ul)。
d.有机、2,4-D、Cb、Hyg混匀,抽滤。
(23)可以看到愈伤一天一天开始慢慢褐化,就像死了一样;
(24)筛选培养基II(Hyg50)的配制(800ml):
780mlNB+16ml有机+1.6ml2mgL-12,4-D+2ml100mg/mlCb+900ul
方法同上(略)
(25)分化培养基的配制(800ml):
780mlNB+16ml有机+320ul(1mg/ml)NAA+8mgKT;
pH5.8-5.9。
说明:
a.1mg/mlNAA母液的配制:
配50ml
称50mgNAA加1MKOH直至溶解(一般加1ml就可以溶解),再加
双蒸水定容至50ml。
不用高压,4°
C保存。
b.分开抽滤:
16ml有机和320ul(1mg/ml)NAA混匀一起抽滤;
8mgKT用1ml1MKOH溶解,再加9ml双蒸水,混匀,抽滤;
(因为KT和有机、NAA会形成结晶,所以要分开抽滤)。
注:
8mgKT务必要称精确,用新的电子天平,勿用一楼的电子天平。
或者称24mgKT,加3ml1MKOH溶解,再加27ml双蒸水混匀,抽滤10ml即可。
c.800ml倒18个100ml三角瓶(每瓶约45ml)。
(26)经验发现团放比分散放置出苗率高。
(27)生根培养基:
1/2MS培养基;
pH5.8-5.9。
(28)25°
要恒温,不能一会28°
一会25°
,那样分化瓶壁上会出现很多水,影响苗的生长。
(29)生根培养基的配制
(30)操作很重要,严格执行,一大意就很容易污染。
操作时务必用长镊子,不能用手弄,用涂过酒精的手弄后期绝大部分会长真菌。
(31)这10天要常观察,一发现有污染的情况,即刻转移;
一般2天后就可发现根往瓶底部长,4天后发现苗明显转绿,茎变粗壮;
7天后发现有明显侧须根长出;
根很多;
(32)一定要浸过培养基,没的话容易长菌;
(33)若长菌则换水。
(34)水稻高温下长势很好(大于28°
(35)注意防虫,必要时15-30天打一次农药。
被带毒的虫子吃了的话,一但传上毒,实验就前功尽弃!
所以,在防虫方面,务必认真对待。
附录•转基因培养基的配方
1.NB培养基配方(基本培养基)
N6大量
工作浓度(mg/l)—
—母液:
10x,1L(g)—
KNO3
2830
28.3
(NH4)2SO4
463
4.63
KH2PO4
400
4
MgSO47H2O
185
1.85
CaCb2H2O
166
B5微量工作浓度(mg/l)母液:
100x,1L(g)
H3B0430.3
MnSO4H2O7.580.758
ZnSO47H2O20.2
KI0.750.075
Na2MoO42H2O0.250.025
CuSO45H2O0.0250.025
C0CI26H2O00250.0025
铁盐
工作浓度(mg/l)
母液:
100x
1L
(g)
jy<
ittIa
FeSO47H2O
N/EDTA
27.8
373
2.78
373
肌醇
丿J丿U|-|J
肌醇Myo-inositol
100
10
11—
iy丿
)4jui—ijiviyoiiiodiloi
有机成分
1\J\J
工作浓度(mg/l)
1
母液:
:
50X,
4L-
—
盐酸硫盐酸吡尼克酸Niacin水解酪蛋白
2.
AAM培养基配方
3.
MS培养基配方
100x1L(g)
TAFTTL
FeSO4.7H2O
Na2EDTA
1\入・1w丿、,II—vy/
3.73
278
有机成分
―母液:
50X,1L(g)——
CuSO4.5H20
0.0025
5
甘氨酸
0.1
盐酸吡哆醇(VB6)
尼克酸
0.5
05
0.025
0025
蔗糖
20000
琼脂
9-95
PH
58
羧卞青霉素(cb)
250mg/l
100mg/ml
潮霉素(hyg)
30-50mg/l
50mg/ml
利福平(rif)
50mg/l
20mg/ml
卡钠霉素(kana)
四环素(tet)
4mg/l
10mg/ml
氨卞青霉素
NAA奈乙酸
400ug/l
1mg/ml
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