聚合酶链式反应实验报告Word格式文档下载.docx
- 文档编号:20984087
- 上传时间:2023-01-26
- 格式:DOCX
- 页数:18
- 大小:28.23KB
聚合酶链式反应实验报告Word格式文档下载.docx
《聚合酶链式反应实验报告Word格式文档下载.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《聚合酶链式反应实验报告Word格式文档下载.docx(18页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
TAE缓冲液至刚好没过凝胶(有样品孔的一端靠近负极)。
取15μlPCR产物与3μl的6×
上样缓冲液混匀,加入到凝胶样品孔中。
每加完一个样品应更换一个吸头。
加样前,要记下加样的顺序。
在每排样品孔中留出一个位置加入5μl的marker。
加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压100V,样品由负极向正极移动。
当溴酚蓝移动到距离凝胶下缘约1/3时,停止电泳。
电泳完毕后,取出凝胶,采用凝胶成像系统拍照保存。
三、实验小结
(一)实验结果
PCR产物电泳结果
由上图可以看出,样品1和样品6出现了目的条带(大小约20bp),所以DNA模板1为猪肉DNA,DNA模板3为牛肉DNA,DNA模板2为兔肉DNA。
(二)实验讨论
1.在加入Taq酶时,应始终保持酶在冰浴中,不可握在手中。
2.每加完一次酶,都应更换吸头。
因为在加酶时,吸头会插入液面以下,为防止污染,应更换吸头。
3.拔出梳子时,应两端一起用力,垂直,缓慢地拔出,以免破坏胶孔。
4.将样品与上样缓冲液混合时,要反复吸进,挤出溶液。
为防止出现较多气泡,在每次挤出溶液时,可在吸头中残留少量溶液。
5.在加样时,吸头要垂直于凝胶板且不要插入太深,以免破坏样品孔。
6.我们组的电泳图中,条带不是很明显,应该是加样时样品的量不够充足,以后应注意。
篇二:
pcr实验报告
7月19日高遄
实验目的:
了解pcr技术原理,掌握最基础的pcr实验步骤。
实验试剂:
模板dna,mg2+,buffer,dntps,taqdna聚合酶,引物,h2o,石蜡油。
实
验原理:
?
pcr全称聚合酶链反应,是体外快速扩增特定基因或dna序列最常用的方法。
?
基本原理:
首先将双链dna分子在临近沸点的温度下加热分离成2条单链dna分子,
dna聚合酶以单链dna为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新的dna互补
链。
pcr反应时,只要在试管内加入模板dna、pcr引物、四种核苷酸及适当浓度的mg2+,dna
聚合酶就能在数小时内将目标序列扩增100万倍以上。
(1)双链模板dna分子首先在高温下解开成长的单链,短链引物分子立即与该模板dna两端的特定序列相结合,产生双链区。
(2)dna聚合酶从引物处开始复制其互补链,迅速产生与目标序列完全相同的复制品。
(3)在后续反应中,无论是起始模板dna还是经复制的杂合dna双链,都会在高温下
解
开成为单链,体系中的引物分子再次与其互补序列相结合,聚合酶也再度复制模板dna。
(4)由于在pcr反应中选用的一对引物,是按照与扩增区域两端序列彼此互补的原则
设计
的,因此每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始并朝反方向延伸的,每一
条新合成的dna链上都有新的引物结合位点。
(5)整个pcr的反应全过程,即dna解链(变性)、引物与模板dna结合(退火)、dna合成(链的延伸)三步可以被不断重复。
经多次循环之后,反应混合物中所含有的双链
dna分子数,即两条引物结合位点之间的dna区段的拷贝数,理论上的最高值应该是2^n,能
进一步满足遗传分析的需要。
试剂作用:
(1)引物:
dna复制的起始点,针对复制dna片段的两端,有5’引物和3’引物
(2)taqdna聚合酶:
促进dntps与模板结合。
(3)buffer:
tris-hcl反应缓冲液,taqdna聚合酶提供一个最适酶催反应条件。
(4)mg2+:
对pcr扩增效率影响很大,浓度过高可降低pcr扩增的特异性,浓度过低
则
影响pcr扩增产量甚至使pcr扩增失败而不出扩增条带。
(5)dntps:
底物,在引物引导下合成与模板互补的dna新链。
(6)石蜡油:
防止pcr加热过程中dna蒸发。
试剂配置体积:
(1)热启动:
94℃,5~10min
(2)变性:
94℃,45~60s。
(3)退火:
50~65℃,1min。
退火温度计算:
tm-(5℃~10℃),tm(解链温度)=4(g+c)+2(a+t)。
(4)延伸:
72℃,1~1.5min。
(5)步骤
(2)~(4)热循环25~30个周期
(6)保温:
延伸72℃,10min?
产物检测:
凝胶电泳。
实验步骤:
(1)设计20μl体系各试剂配比:
(2)按照预先设计的20μl体积配置6管试管量,实际加入量如下表
(3)完成后分6管加入pcr管中,每管15μl体积,标注1-6号码。
(4)在前1-~4号pcr管中加入模板dna,在5号管中加入c3h模板作为阳性参照,6
号中不加任何模板dna,作为阴性参照。
(5)在加完模板的6管试剂中各加入20μl石蜡油
(6)将pcr管放入pcr仪,按之前设定的加热温度与时间设置a.热启动:
94℃,2min;
80℃,1min;
此时在各管中加入dntps4μlb.变性:
94℃,30s;
c.退火:
65℃,1.5min;
d.延伸:
72℃,2min步骤b~d循环40次
e.保温:
72℃,10min
(7)完成后用3琼脂糖凝胶(60ml)电泳进行检测。
实验结果:
pcr目标产物约为295bp
琼脂糖凝胶电泳结果如下图所示123456marker1、2号泳道为♂性小鼠dna模板的pcr产物3、4号泳道为♀性小鼠dna模板的pcr产物5号泳道为c3h阳性参照6号泳道为阴性参照
由marker参照可知,pcr产物大小约为290~300bp篇二:
聚合酶链式反应pcr实验报告实验二聚合酶链式反应(pcr)
一、实验原理
聚合酶链式反应(pcr)是利用dna片段旁侧两个短的单链引物,在体外快速扩增特异
dna片段的技术。
它应用热稳定的聚合酶,通过双链dna模板的热变性、引物退火和引物延
伸的重复循环,dna片段以指数方式增加了百万倍。
从非常微量的dna甚至单个细胞所含有
的dna起始,可产生ug量的pcr产物。
二、器材与试剂
1.器材:
移液器,ep管,热盖pcr仪,电泳仪,量筒,锥形瓶,微波炉,电子天平,紫
外照色仪
2.试剂:
引物,模板,taqdna聚合酶,原料(dntps),缓冲液与mg2+,h2o,2pcrmi
溶液,dna染料
三、实验步骤
pcr反应体系的建立
取离心管,依次加入试剂混匀
1.h2o12μl
2.模板1μl
3.引物t71μl
4.引物sp61μl
5.2pcrmi15μlpcr仪的热循环反应
把离心管放入pcr仪中,由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成
1.
模板dna的变性:
模板dna经加热至94℃左右一定时间后,使模板dna双链或经pcr
扩增形成的双链dna解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
2.
模板dna与引物的退火(复性):
模板dna经加热变性成单链后,温度降至56℃左右,
引物与模板dna单链的互补序列配对结合;
3.
引物的延伸:
经加热至72℃左右dna模板--引物结合物在taqdna聚合酶的作用下,
以dntp为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模
板dna链互补的半保留复制链。
重复该循环30次,每次需要2-3分钟。
电泳检测结果
扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中,电泳结束后,放到紫外照射仪中进行透射,电泳明胶显
示清晰的条带,如下图所示加入的为1号样,出现在500bp左右条带,而预算结果为扩增出
492bp条带,故实验成功。
四、讨论
mg2+离子浓度对pcr扩增效率影响很大,浓度过高可降低pcr扩增的特异性浓度过
低则影响pcr扩增产量甚至使pcr扩增失败而不出扩增条带。
变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;
退火温度过低,可致非特异性扩增
而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低pcr扩增效率。
eb:
溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂,用于观察琼脂糖中的dna,可与dna结
合,用标准302nm紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号。
4.
溴酚蓝:
电泳指示剂,相当于300bp的dna的电泳速度。
5.
100bpdnamarkerⅰ是由单独的pcr扩增产物混合而成,已含有1loadingbuffer,
可以直接电泳。
包括11条双链dna片断:
100bp、20bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、
800bp、900bp、1000bp和1500bp。
特异性加强500bp。
每次上样4~5μl。
6.
模板一般采用50ng-1ug或102--105拷贝,浓度过高反而会抑制反应的进行。
7.
引物的与模板的互补程度决定了pcr的特异性,常用0.1—0.5um,浓度过高则特异
性下降,会形成引物二聚体影响试验结果。
五、结果及结论:
经电泳检测到pcr扩增产物中出现500bp左右条带,pcr扩增成功。
篇三:
pcr扩增反应
的操作实验报告1pcr扩增反应的操作实验报告实验原理:
以单链dna为模板,4种dntp为底物,在模板3’末端有引物存在的情况下,用酶进行
互补链的延伸,多次反复的循环能使微量的模板dna得到极大程度的扩增。
在微量离心管中,
加入与待扩增的dna片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的dna膜
板、四种dntp溶液、耐热taqdna聚合酶、mg2+等。
反应时先将上述溶液加热,使模板dna
在高温下变性,双链解开为单链状态;
然后降低溶液温度,使合成引物在低温下与其靶序列
配对,形成部分双链,称为退火;
再将温度升至合适温度,在taqdna聚合酶的催化下,以
dntp为原料,引物沿5’→3’方向延伸,形成新的dna片段,该片段又可作为下一轮反应的
模板,如此重复改变温度,由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期,反复循环,使
目的基因得以迅速扩增。
因此pcr循环过程为三部分构成:
模板变性、引物退火、热稳定dna
聚合酶在适当温度下催化dna链延伸合成。
实验步骤:
一、pcr反应的条件pcr反应条件为温度、时间和循环次数。
1.温度与时间的设置
(1)变性温度与时间:
变性温度低,解链不完全是导致pcr失败的最主要原因。
一般情况下,93℃~94℃lmin足以使模板dna变性,若低于93℃则需延长时间,但温
度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。
此步若不能使靶基因模板或pcr产物完全变
性,就会导致pcr失败。
(2)退火(复性)温度与时间:
退火温度是影响pcr特异性的较重要因素。
变性后温度快速冷却至40℃~60℃,可使引物和模板发生结合。
由于模板dna比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。
退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。
对于20
个核苷酸,g+c含量约50的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
(3)延伸温度与时间:
taqdna聚合酶的生物学活性:
70~80℃,150核苷酸/s/酶分子;
70℃,60核苷酸/s/酶分子;
55℃,24核苷酸/s/酶分子;
高于90℃时,dna
合成几乎不能进行。
(4)pcr反应的延伸温度一般选择在70~75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
pcr延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度
而定,一般以内的dna片段,延伸时间1min是足够的。
3~4kb的靶序列需3~4min;
扩
增10kb需延伸至15min。
延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。
对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些。
2.循环次数
循环次数决定pcr扩增程度。
pcr循环次数主要取决于模板dna的浓度,一般的循环次
数选在30~40次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多。
二、pcr扩增产物分析pcr产物是否为特异性扩增,其结果是否准确可靠,必须对其进行严格的分析与鉴定,
才能得出正确的结论。
pcr产物的分析,可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。
1.凝胶电泳分析:
pcr产物电泳,eb溴乙锭染色紫外仪下观察,初步判断产物的特异性。
pcr产物片段的大小应与预计的一致,特别是多重pcr,应用多对引物,其产物片断都应符合
预讦的大小,这是起码条件。
(1)琼脂糖凝胶电泳:
通常应用1~2的琼脂糖凝胶,供检测用。
(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳:
6~10聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好,条带比较
集中,可用于科研及检测分析。
2.酶切分析:
根据pcr产物中限制性内切酶的位点,用相应的酶切、电泳分离后,获得
符合理论的片段,此法既能进行产物的鉴定,又能对靶基因分型,还能进行变异性研究。
验结果:
无篇四:
dna提取+pcr+电泳实验报告
题目:
水稻dna提取,扩增与电泳实验组别:
第三组
一、1掌握dna的提取技术2掌握pcr的相关操作3掌握了解电泳操作方法和步骤
二、实验原理:
1、提取dna一般用水稻幼叶,先用机械方法液氮研磨植物组织使组织细
胞破碎,然后加tps抽提液水浴提取dna,最后用无水乙醇沉淀dna即可。
(dna提取原理)
2、dna在高温时可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。
(pcr原理)3、
琼脂糖凝胶电泳:
借助琼脂糖凝胶的分子筛作用,核酸片段因其分子量或分子形状不同,电
泳移动速度有差异而分离。
三、实验仪器和药品
液氮、镊子、手套、移液枪、枪头2ml和1.5ml离心管、水稻幼叶、研磨棒、琼脂糖、
天平、pcr仪、loadingbuffer染色剂、灭菌双蒸水、摇床、离心仪、taq酶、mg2+buffer、
dntp溶液、引物、tps抽提液、无水乙醇、电泳槽、goldview、tbe溶液、微波炉、锥形瓶、
量筒、pcr板、pcr盖、水浴箱、marker
四、实验步骤
1、dna提取
(1)取水稻叶子少量置于2ml离心管内,加入液氮研磨,带磨成粉状后,加1mltps抽
提液,然后将离心管放入75℃恒温水浴箱中至少半小时。
同时将无水乙醇放入-40℃下冷冻
(2)水域结束后,取出离心管放入离心仪中,13600r/min离心12min,然后小心的取出
离心管,将上清液转移到1.5ml离心管中0.5ml,加入600ul冷冻的无水乙醇,放入-80℃下
冻10min,拿出放入离心仪13600r/min离心5min
(3)到处上清液,倒置,晾干约3h
(4)加入双灭菌水60ml,放入摇床中振荡一夜。
2、pcr
(1)按所需配料表,向pcr板中加入双蒸水,mi,前引物,后引物,然后加入提取的dna,
混匀
(2)将pcr板放入pcr仪中运行ssr程序
3、电泳
(1)称取0.3g琼脂糖和30mltbe溶液。
混匀倒入锥形瓶中,加热溶解混匀。
RT-PCR实验报告
逆转录pcr
rt-pcr为反转录rcr(reversetranscriptionpcr)和实时pcr(realtimepcr)共同的缩写。
逆转录pcr,或者称反转录pcr(reverse
transcription-pcr,rt-pcr),是聚合酶链式反应(pcr)的一种广泛应用的变形。
在rt-pcr
中,一条rna链被逆转录成为互补dna,再以此为模板通过pcr进行dna扩增。
由一条rna单链转录为互补dna(cdna)称作“逆转录”,由依赖rna的dna聚合酶(逆转
录酶)来完成。
随后,dna的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖rna的dna聚合酶完成,
随每个循环倍增,即通常的pcr。
原先的rna模板被rna酶h降解,留下互补dna。
rt-pcr的指数扩增是一种很灵敏的技术,可以检测很低拷贝数的rna。
rt-pcr广泛应用
于遗传病的诊断,并且可以用于定量监测某种rna的含量。
(检测基因表达的方法,参见
northernblot法。
)
rt-pcr有时候也会指代实时pcr(real-timepcr)。
为了与逆转录pcr相区别,通常被写
作“定量pcr”(quantitativepcr)或者rtq-pcr(real-timequantitativepcr)。
实时pcr实时pcr(real-timepcr),属于定量pcr(q-pcr)的一种,以一定时间内dna的增幅量
为基础进行dna的定量分析。
realtimepcr的定量使用萤光色素,目前有二种方法。
一种是在dsdna中插入特异的萤光色素;
另一种使用一种能与增幅dna序列中特定寡核酸序
列相结合的一种萤光探针(probe)。
realtimepcr与reversetranscriptionpcr相
结合,能用微量的rna来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。
这两种rtpcr
的组合又被称之为“定量rt-pcr(quantitativert-pcr)”rt-pcr技术相关试剂
oligo:
多聚体,相当于mrna引物amv(m-mlv):
逆转录酶dntp:
脱氧核苷酸
rnase:
rna酶抑制剂
pcrbuffer:
rt-pcr缓冲液mgcl2:
2价镁离子
pcr各步骤的目的
(一)预变性:
破坏dna中可能存在的较难破坏的二级结构。
使dna充分变性,减少dna复杂结构对
扩增的影响,以利于引物更好的和模板结合,特别是对于基因组来源的dna模板,最好不要
吝啬这个步骤。
此外,在一些使用热启动taq酶的反应中,还可激活taq酶,从而使pcr
反应得以顺利进行。
(二)变性--退火--延伸循环:
①模板dna的变性:
模板dna经加热至93℃左右一定时间后,使模板dna双链或经pcr
②模板dna与引物的退火(复性):
模板dna经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,
③引物的延伸:
dna模板--引物结合物在taqdna聚合酶的作用下,以dntp为反应原料,
靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板dna链互补的半保留复
制链。
(三)pcr仪扩增循环后72度延伸10分钟用pcr仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因:
1.延伸时间取决于待扩增dna片段的长度。
(当然是在反应体系一定的条件下)例如,使
用taqdna聚合酶,72度时的碱基掺入率为35-100bp/s,因此延伸速率为/min。
2.根据延伸速率推得,扩增以内的dna片段1min即可,而3-4kb则需要3-4min,
依次照推。
通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min,这样做是使pcr反应完全以提高扩增产量。
3.继续72度延伸了10分钟除了可以使pcr反应完全以提高扩增产量外,还有一个作用
是:
在用普通taq酶进行pcr扩增时在产物末端加a尾的作用,可以直接用于ta克隆的进行。
什么是半定量pcr
半定量反转录-聚合酶链反应(semi-quantitativereversetranscriptionand
polymerasechainreaction,sqrt-pcr)是近年来常用的一种简捷、特异的定量rna测定方
法,通过mrna反转录成cdna,再进行pcr扩增,并测定pcr产物的数量,可以推测样品中
特异mrna的相对数量。
以半定量rt-pcr为基础建立起来的mrna含量测定技术,较含内标化
的rt-pcr定量测定的mrna的方法更为简便可行。
这种方法不另设‘内标准,排除了俩对不
同引物之间的相互抑制和灵敏读差异,而且具有明显的剂量-效益关系和良好的重复性。
步
骤:
1.抽提rna,2.反转录获得cdna,3.以cdna为模板做pcr注意:
步骤1,rna抽提质量一定要好,注意污染。
内参的选择,常用的有βactin和gapdh俩中。
步骤
3,半定量rt-pcr应该再两管中进行,既内参
和目的基因各一管,这样便于控制,做图的时
候可以放在一各泳道里跑!
指数期和平台期一定要摸清楚!
半定量rt-pcr与荧光定量real-timepcr最大的区别就在于semi-pcr需要跑电泳根
据条带亮度的强弱来判断模板拷贝数的高低或者是表达量的高低而real-timepcr则无需
电泳可以实时监测整个pcr的全程并且由给出的ct值及standardcurve来判断gene拷贝
数的高低。
所以由上可见semi-pcr不如real-timepcr精确。
至于rt应该指reversetranscription。
为了便于区分我们更偏好使用qpcr来特指real-timepcr同时要注意realtime-pcr的定性问题,有时候你扩增出来的很有可能只是引物二聚体。
所以要利用meltingcurve
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 聚合 链式反应 实验 报告