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相对活力分数(残余活力分数)、相对活力百分数(残余活力百分数)
抑制分数:
指被抑制而失去活力的分数、抑制百分数
IC50:
酶的活性抑制50%时所需的酶抑制剂浓度。
通常所谓抑制率是指抑制分数或抑制百分数。
3、抑制作用的分类
酶的竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制之间的异同点
(1)不可逆抑制作用:
抑制剂与酶分子上的某必需基团以共价键结合,使酶失活,不能用透析、过滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。
A非专一性不可逆抑制剂:
有些不可逆抑制剂能与酶分子中一类或几类基团反应,称为非专一性不可逆抑制剂。
如重金属离子:
共价结合巯基、氨基和吲哚基,从而使酶失活。
B专一性不可逆抑制剂:
Ks型不可逆抑制剂:
根据底物的化学结构而设计的抑制剂,具有和底物类似的结构,可以和相应酶相结合,同时所带活泼化学基团化学修饰酶分子中必需基团从而抑制酶的活性。
这种抑制剂是通过其对酶的亲和力而对酶进行修饰标记的,所以又称亲和标记试剂。
Kcat(catalyze)型不可逆抑制剂(自杀性底物):
具有与天然底物相类似的结构,本身也是酶的底物,被酶催化后,潜伏性的反应基团因酶的催化而暴露或活化,作用于酶的活性中心或辅基,使酶被共价修饰而失活。
(2)可逆抑制作用:
抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活性的降低或丧失,能用物理的方法除去抑制剂而使酶复活者称为可逆抑制作用。
竞争性抑制:
在反应体系中存在有与底物结构相类似的物质,该物质能在酶的活性部位上结合,从而阻碍了酶与底物的结合,使酶催化底物的反应速率下降。
如二氢叶酸合成酶:
对氨基苯甲酸→二氢叶酸,其竞争性抑制剂:
对氨基苯磺酸。
大多数竞争性抑制剂的结构与底物类似的;
抑制程度取决于底物及抑制剂的相对浓度,可通过增加底物浓度而解除抑制。
非竞争性抑制剂:
若抑制剂在酶的底物结合部位以外的必需基团与酶结合,并且这种结合与底物的结合没有竞争关系,这种抑制称为非竞争性抑制作用;
抑制作用不能用增加底物浓度来解除;
某些重金属离子对酶的作用属于此类抑制。
反竞争性抑制剂:
抑制剂不能直接与游离酶相结合,而只能与复合物ES相结合生成ESI复合物;
常见于多底物反应中,单底物反应中比较少见。
(3)可逆抑制作用和不可逆抑制作用的鉴别:
物理方法:
用透析、超滤和凝胶过滤等方法是否能除去抑制剂来鉴别可逆抑制作用和不可逆抑制作用。
②动力学方法:
在测定酶活力系统中加入一定量的抑制剂,测定酶反应的初速度,以初速度和酶浓度作图。
4、酶抑制反应动力学
(1)米氏方程及双倒数作图
V0=Vmax[S]/(Km+[S])
双倒数图:
测定抑制剂如何与酶结合。
(2)
5、酶抑制剂及其制备、应用
(1)、酶抑制剂概念:
使酶活性降低乃至完全丧失活性的配体。
(2)简述酶抑制剂的设计和筛选方法
基于过渡态底物类似物结构进行设计,基于Kcat型不可逆抑制机制进行设计
产酶抑制剂的微生物
组合化学法
基于化学合成与计算机技术相结合的组合化学法是酶抑制剂筛选的全新方法,其基本原理是借助组合合成仪,同时合成出大量不同化合物,并通过高通量群集筛选技术得到最有潜力的先导物.
高通量筛选法
高通量筛选法是在传统筛选技术的基础上,将先进的分子生物学,细胞生物学,计算机,自动化控制等多种技术方法有机结合而形成的,更适合酶抑制剂筛选的技术体系,目前已经用于新药的筛选.
b、建立筛选模型
分子水平的药物筛选模型:
受体筛选;
酶筛选;
离子通道筛选.
细胞水平药物筛选模型:
细胞调亡;
转录调控;
信号传导;
细菌生长;
细菌蛋白分泌
(3)举例阐明酶抑制剂在医药产品和农业中的作用的原理和应用前景
二氢叶酸合成酶催化苯甲酸生成二氢叶酸,二氢叶酸还原酶催化二氢叶酸生成四氢叶酸。
四氢叶酸是合成核酸的辅酶。
磺胺是苯甲酸的类似物,竞争性抑制二氢叶酸合成酶,造成细菌核酸合成障碍,导致细菌死亡。
以下两个例子任选一个。
EPSP合成酶的生理作用与草甘膦的抑制作用
EPSP合成酶:
5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶。
EPSP合成酶是芳香族氨基酸——色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸生物合成过程中的合成酶,芳香族氨基酸参与植物体内一些生物碱、香豆素、类黄酮、木质素、酚类物质等的次生代谢。
草甘膦施用后被植物迅速吸收,并随同化产物传导至整个植株,因其阻断了芳香族氨基酸的生物合成,对植物细胞分裂、叶绿素合成、蒸腾、呼吸以及蛋白质等代谢过程产生影响而导致植物死亡(竞争抑制,非选择性)。
植物5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶的cDNA克隆,连接CaMV启动子,通过Ti质粒载体导入矮牵牛目前已将这种修饰过的基因导入烟草和矮牵牛,提高除草剂作用靶酶的剂量,并对草甘膦产生了抗性。
谷氨酰胺合成酶(GS)及其抑制剂膦丝菌素GS的生理功能及酶学特征。
谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase(GS),催化无机氮向有机氮的转化反应,植物体中的GS是将氨固定到有机物当中。
膦丝菌素(PPT)的抑制机理是竞争性的与谷氨酰胺合成酶结合,抑制无机氮向有机氮的转化。
从链霉菌中克隆编码使膦丝菌素乙酰化而失活的酶的基因Bar基因,连接CaMV启动子,并将其转化到土豆。
Bar基因能合成乙酰转移酶,解除非选择性除草剂PPT对植物谷氨酰胺酶的抑制,避免植物细胞因为氨的积累而死亡。
目前已将这个基因导入小麦、烟草、马铃薯、甜菜等作物,其中转基因马铃薯已进行大田试验并取得良好效果。
(4)农用除草剂一般为非选择性的,举例阐明转基因植物杀虫、抗除草剂机制。
胆固醇氧化酶基因也被称为第二代抗虫基因,其表达的产物是一类新型杀虫剂。
在链霉菌属(Streptomyces)、短杆菌属(Brevibacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红球菌属(Schizopylium)等细菌中均发现有胆固醇氧化酶。
目前已从链霉菌属中分离出胆固醇氧化酶基因,其编码的胆固醇氧化酶属于乙酰胆固醇氧化酶家族的成员,可催化胆固醇形成17-酮类固醇和过氧化氢。
胆固醇是细胞膜的主要组分,伴随着上述反应,摄食昆虫的肠道表皮细胞出现胞溶现象,由此导致昆虫死亡。
第三章酶的发酵生产
1、酶的发酵生产:
经过预先设计,通过人工操作控制,利用细胞(包括微生物细胞,植物细胞和动物细胞)的生命活动,产生人们所需要的酶的过程。
2、酶发酵生产的工艺流程:
保藏菌种、菌种活化、菌种扩大、培养发酵、分离纯化。
3、酶发酵生产的细胞必需具备如下条件
(1)酶的产量高;
(2)产酶稳定性好;
(3)容易培养和管理;
发酵周期短,营养需求简单;
(4)产物杂质少,利于酶的分离纯化;
(5)安全可靠,非致病性.
4、在工业生产中,动植物细胞产酶和微生物细胞产酶相比的优缺点
(1)动植物细胞培养缺点
动植物细胞体积大、对剪切力敏感,要求特殊生物反应器。
动植物细胞生长速率、代谢速率低,发酵周期长,对防止杂菌污染的技术要求高。
动物细胞营养要求苛刻.
(2)利用微生物产酶的优点
、种类多,酶种丰富,易筛选突变株
、生长周期短
、培养基便宜,条件简单
、基因工程
5、酶活检测定义:
是对酶功能的检测.酶活检测是探测酶催化反应的化学机理,并使其可视化.如光信号,底物颜色变化,或者是生物选择。
1)根据颜色变化的检测法
2)利用pH指示剂的检测法
3)基于NAD(P)H消耗的检测法
4)以流动-注射式NMR作为分析工具的检测法
6、微生物发酵产酶方式:
固体培养、液体深层发酵、固定化细胞发酵
7、高产酶菌株收集的来源:
土壤;
发酵生产材料;
菌种保藏中心
8、酶发酵动力学:
研究发酵过程中速率及其影响因素的科学。
包括细胞生长动力学、反应基质消耗动力学和酶生成动力学等。
9、细胞生长动力学
(1)单批培养:
μ=dx/dt*1/x=μm*s/(ks+s)
(2)连续培养:
以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法,即恒化培养。
通过调节培养基流速,使培养液浊度保持恒定的连续培养方法,即恒浊培养。
(dx/dt)体系=μx-F/V*x=(μ-D)x
当μ>
D时x增加
当μ=D时x保持恒定
当μ<
D时x降低
当μm=D时细胞冲出
10、产酶动力学
(1)产酶动力学主要是研究细胞产酶速率及各种因素对产酶速率的影响。
dE/dt=α·
dX/dt+β·
X
α生长偶联的产酶比系数(IU/g)
β非生长偶联的产酶比系数(IU/g)
(2)酶生成动力学有哪些类型,它们分别有哪些特征?
在生产上我们可以采取哪些措施提高酶的产量?
同步合成型延续合成型中期合成型滞后合成型
A、同步合成型酶的生物合成可以诱导,但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。
这类酶所对应的mRNA很不稳定。
dX/dt
B、延续合成型酶的生物合成可以诱导,但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。
这类酶所对应的mRNA相当稳定。
C、中期合成型酶的生物合成受到反馈阻遏,而且其所对应的mRNA不稳定。
dE/dt=α·
dX/dt(α=0存在阻遏物,α<
>
0解除阻遏物)
D、滞后合成型酶的生物合成受分解代谢物阻遏作用(葡萄糖),这类酶所对应的mRNA稳定性高。
dE/dt=β·
X
策略措施:
①菌种选育:
提高mRNA的稳定性(降解酶的失活),解除分解代谢物阻遏和反馈阻遏(突变)。
②发酵代谢调节:
理想诱导物(毒性)的添加,解除反馈阻遏和分解代谢物阻遏(补料发酵)。
③降低产酶温度,提高mRNA的稳定性。
(3)总结:
mRNA的稳定性,培养基中诱导物,反馈阻遏物,分解代谢物的存在是影响酶生物合成模型的主要因素。
最理想的合成模式:
延续合成型
mRNA稳定性代谢调节
同步合成型(-)诱导
延续合成型(+)诱导
中期合成型(-)反馈阻遏(解除阻遏后)
滞后合成型(+)分解代谢物阻遏
11、发酵过程中控制发酵液pH值的必要性和方法。
12、发酵产酶培养基调整的必要性
13、根据酶生物合成的调节类型及机制说明如何提高酶的产量。
14.优良产酶微生物菌种的获得途径及各自特点(自己整理)。
第四章固定化酶和固定化细胞
1、固定化酶:
凡限制在一定的空间范围内并能连续反复地使用的酶。
第一次用于工业生产的固定化酶是:
1969年千钿一郎,固定氨基酰化酶生产D,L-氨基酸。
2、比较游离酶、固定化酶、固定化细胞作为生物催化剂的优点和缺点。
游离酶:
(1)酶在水溶液中参与反应,难以回收酶,导致应用生产成本高,而且应用过程难于连续化;
(2)酶蛋白残留给产物的分离纯化带来困难(3)酶的稳定性一般较差,易受环境影响(物理因素、化学因素、生物因素),活力下降甚至失活。
固定化酶:
(1)优点:
重复使用;
产物易于分离;
稳定性提高;
连续加工。
(2)缺点载体昂贵;
特性会发生改变;
部分酶活力丧失;
辅因子再生及多酶反应存在问题。
固定化细胞:
省去酶分离过程;
辅因子再生及多酶反应;
稳定性提高缺点:
细胞内蛋白酶对所需酶的分解;
副产物;
细胞壁和膜阻碍底物和产物的渗透、扩散。
3、常见固定化方法有哪些类型?
其概念和特点以及各自的优缺点及适用范围。
(1)吸附法是利用氢键,范德华力、离子键、疏水作用力、静电等弱的相互作用使酶吸附在载体表面,包括物理吸附、离子吸附、疏水吸附和亲和吸附。
(2)包埋法将酶包裹于凝胶格子或聚合物半透膜微胶囊中的方法。
根据载体材料和方法的不同,可分为格子型包埋法和微胶囊法(微胶囊法只适用于底物和产物都是小分子物质的固定化)。
(3)共价法:
通过共价键将酶与载体结合的固定化方法。
(酶分子表面的功能集团与载体表面的功能集团发生化学反应形成共价键的一种固定化方法)
优点;
稳定性好;
缺点:
反应条件激烈,操作复杂,控制条件苛刻,相对酶活力较低。
不需要化学修饰,反应条件温和,适合大多数酶;
,粗酶制剂,甚至完整细胞。
优点:
结合牢固,可长时间使用;
交联法单用时,所得到的固定化酶,颗粒小,机械性能差,酶活性低。
(4)交联法:
借助双功能或多功能试剂使酶分子之间发生交联作用,制成网状结构的固定化酶的方法。
吸附法:
制备容易,易流失,能再生,底物专一性不变,空间位阻小。
包埋法:
制备难,不能再生,对小分子底物专一性不变,空间位阻大。
共价法和交联法制备难,不能再生,底物专一性可变,空间位阻较大。
4、载体类型及其活化方法
(1)来自于自然的有机载体(与酶有很好的相容性)、无机载体(高压稳定性)、无机合成载体(化学及机械稳定性高)
(2)活化方法:
溴化氰法(溴化氰-亚胺碳酸基法):
α、β二羟基载体
重氮法:
芳香族氨基载体
R-X-NH2R-X-N≡NCl-R-X-N=N-enzyme
戊二醛活化法:
含氨基载体
5、酶固定化后性质会发生什么变化?
原因是什么?
(1).稳定性(一般)储存和操作过程中稳定性增强,主要表现在:
①热稳定性,②蛋白质水解酶的抗性,③变性剂的耐受性,④保存期延长。
原因:
a.固定化后酶分子与载体多点连接,使酶分子刚性增加,可防止酶分子伸展变性。
b.酶活力的释放是缓慢的。
c.抑制自降解,提高了酶稳定性。
(2)反应的最适温度(一般)最适温度比天然酶高,最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结果。
(3)反应的最适pH:
载体性质:
微环境
最适pH
载体(-)
吸引H+,pH↓
偏高
载体(+)
吸引OH-,pH↑
偏低
带负电载体(阴离子聚合物)制备的固定化酶,其最适PH较游离酶高,多聚阴离子载体会吸收溶液中阳离子,(包括H+),使其附着于载体表面,使固定化扩散层H+浓度比周围的外溶液高(偏酸),外溶液中PH向碱性方向偏移,才能抵消微环境作用。
产物性质:
产物(酸性)
pH↓
产物(碱性)
pH↑
反应产物为酸性时,由于扩散受到限制而积累在固定化酶所处的催化区域,使此区域内PH降低,必须提高周围反应液的PH,才能达到酶所要求的最适PH。
反应物为中性时,,由于固定化载体成为扩散屏障,使反应物向外扩散受到一定限制所造成。
(4)底物特异性
底物专一性:
由于空间位阻效应,固定化酶对高分子量底物的活性降低,对低分子量底物的反应速率变化不大。
大分子底物难于接近酶分子而使催化速度大大降低,小分子底物受到空间位阻作用的影响较小或不受影响。
(5)酶活力:
酶经固定化后大部分活力下降,酶活性中心的重要氨基酸与水不溶性载体相结合,活化中心的结构发生变化,酶与底物相互作用受到空间位阻干扰,可在固定的同时加入酶活性中心保护剂,如底物产物或其类似物来提高固定化酶活性。
固定化细胞所利用的目的酶活性不下降。
6、固定化酶反应动力学
(1)空间效应
1)构象效应:
酶在固定化过程中,由于存在酶和载体的相互作用,从而引起酶空间结构的改变,导致酶催化底物转化能力的改变。
2)位阻效应(空间障碍):
因载体的存在,给酶的活性部位或调节部位造成了空间障碍,使酶的活性下降。
(2)分配效应:
由于固定化酶载体的亲水性、疏水性及静电作用等引起固定化酶内部底物、其他各种效应物(H+,OH-离子,溶剂)以及产物在微环境和宏观体系之间的不等分配,从而影响酶反应速度的现象。
(3)扩散效应:
底物/产物和其他效应物在固定化酶载体内外之间的迁移扩散速度受到某种限制,造成了不等分布,从而影响反应速度。
扩散效应与这些物质的分子量大小,载体的结构及酶反应性质有关。
1)外扩散:
底物/产物和其他效应物在宏观体系与酶颗粒表面间的扩散。
2)内扩散:
在多孔性固定化载体内,底物、产物和其他效应物在载体颗粒表面与载体内的酶活性部位间的扩散。
(4)微扰效应:
由于载体的亲水,疏水作用和介电常数等性质,直接影响酶的催化能力或酶对效应物作出反应的能力。
分配效应动力学
简化:
假定酶被均匀地固定在载体表面,且整个反应系统充分搅拌,混合均匀,排除扩散效应。
荷电载体与荷电溶质静电作用产生的分配效应常用分配系数ρ=[Si]/[S]
Si:
代表底物和其他各种效应物在微环境中的局部浓度
S:
代表底物和其他各种效应物在宏观体系中的总体浓度
对固定化酶催化反应,分配效应仅影响底物浓度分布,酶的动力学方程仍可用米氏方程表示。
V=Vm[Si]/(Km+[Si])=Vm[S]ρ/(Km+[S]ρ)=Vm[S]/(Kappm+[S])其中Kappm=Km/ρ
上式表明,分配效应造成的影响是改变Km。
ρ=[Si]/[S]Kappm=Km/ρ
(1)当载体与底物电荷相同时,[Si]<[S],ρ<1,Kappm>Km
(2)当载体与底物电荷相反时,[Si]>[S],ρ>1,Kappm<Km
上述效应,通过提高反应系统的离子强度,可减弱或消除
(3)采用疏水性载体,
如果底物为极性物质或电荷性物质,则[Si]<[S],ρ<1,Kappm>Km
如果底物为疏水性物质,则[Si]>[S],ρ>1,Kappm<Km
ΔpH=pHi-pH=0.43eΦ/(KBT)
阴离子载体:
ΔpH<
0ΔpH=pHi-pH=0.43eΦ/(KBT)
阳离子载体:
ΔpH>
外扩散效应
反应过程:
底物从反应液主体移向载体表面(底物外部扩散),从载体表面移向酶、细胞作用位点(底物内部扩散),底物被催化生成产物,产物从反应位点移向载体表面,再移至反应主体液。
酶促反应速度=Vm[Si]/(Km+[Si])
底物转移速度=Js([S]-[Si])
(1)当外扩散传质速率很快,固定化酶外表面反应速率相对较慢,并成为该反应过程速率的控制步骤时,则Si=S,此时反应速率:
V=Vm[Si]/(Km+[Si])=Vm[S]/(Km+[S])
(2)当外扩散传质速率很慢,固定化酶外表面反应速率相对较快,此时外扩散速率成为反应的控制步骤,则Si=0,此时反应速率为:
V=Js([S]-[Si])=Js[S]
Thiele准数(西勒准数μ)
μ=Vm[S]/Km/Js[S](酶促反应限速)/(外扩散限速)
=Vm/Km/Js
西勒准数μ反映了外扩散效应对反应动力学的影响,代表外扩散效应的大小。
7、举例说明固定化酶(细胞)的制备过程及实际应用。
8、戊二醛用于固定酶,该方法属于那种酶的固定化方法?
为什么?
9、若需要测定糖蜜发酵生产酒精中的底物蔗糖,试问所需用何种酶。
若需测定谷氨酸发酵中的产物,则考虑用何种酶?
第五章酶的定向进化
1、酶分子的改造有哪几种方法?
(1)酶分子理性设计:
充分认识酶分子特征、空间结构以及结构与功能的关系的基础上,对酶分子进行改造。
化学修饰,定点突变.
(2)酶分子非理性设计:
不需准确知道酶蛋白结构与功能等信息,直接通过随机突变、筛选等方法进行酶分子的改造。
定向进化,杂和进化。
2、酶的定向进化相关概念
(1)酶定向进化的概念:
模拟随机突变和自然选择的进化过程,在体外进行酶基因的人工随机突变,建立突变基因文库,在人工控制的特殊环境下定向选择具有优良催化特性的酶突变体的技术过程。
(2)基本过程:
随机突变、构建突变基因文库、定向选择
(3)体外随机突变(体外分子进化)主要技术:
易错PCR、连续易错PCR、DNA重组(DNAshuffling)、familyshuffling、外显子改组(exonshuffling)、随机引物体外重组法、交错延伸法。
(4)定向选择采用高通量筛选的方法:
平板筛选法、荧光筛选法、噬菌体表面展示法、酵母细胞表面展示法
5、定向进化与定点突变的区别
(1)定向进化:
突变位点是随机的,不确定的;
突变位点的数目也是不确定的;
突变的效应更是不可预知的;
理论上讲,凡是能够引起突变的因素(物理的、化学的、生物的)都可以应用于定向进化中突变体的产生。
(2)定点突变:
突变位点是确定的,突变的个数也是预知的;
突变的效应可能是已知的,也可能是未知的;
定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。
6、简述分子酶工程中Kunkel法定位突变的原理
1)Placetheplasmidthatcontainsyourtargetsequencetobemutatedintoanung-dut-strainofE.colibacteria.dut-(lackingdUTPase脱氧尿苷酸酶)bacteriaaccumulatedUTP.ung-(lackinguracildeglycosidase尿嘧啶糖基化酶)bacteriacannotremovedUTPthatgetsincorporatedintonewDNAstrands.Theendr
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