细菌内毒素检查标准操作规程.docx
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细菌内毒素检查标准操作规程
细菌内毒素检查标准操作规程
细菌内毒素检查标准操作规程
1简述
1.1本规范适用于中国药典2005年版附录中细菌内毒素检查法一凝胶法和光度测定法。
后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时,可使用其中任何一种方法进行实验。
当
测定结果有争议时,除另有规定外,以凝胶法结果为准。
1.2供试品细菌毒素限值的确定。
(一)药典中有规定的,按供试品各论中规定限值;
(二)尚无标准规定的,按以下公式确定供试品内毒素限值:
L=K/M
式中
L为供试品的细菌内毒素限值,以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。
K为按规定的给药途径,人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量,以EU/kg/h表示。
其中注射剂,K=5EU/kg/h;放射性药品注射剂,K=2.5EU/kg/h;鞘内用注射剂,
K=0.2EU/kg/h。
M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量,以ml/kg/h、ml/kg/h、U/kg/h表示。
药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作,中国人
均体重按60kg计算,注射时间小于1小时的按1小时计。
按人用剂量计算限值时,如遇特殊情况,可根据生产和临床用实际情况做必要调整,但需说明理由。
1.3供试品最大有效稀释倍数的确定
供试品的最大有效稀释倍数(MVD)按下式计算:
MVD=C?
L/λ
L为供试品的细菌内毒素限值;C为供试品溶液的浓度。
当L以EU/ml表示时,C等于1.0ml/ml;当L的单位以EU/mg或EU/U表示时,C为供试品制备成溶液后的浓度,单位为mg/ml
或U/ml。
如供试品为注射用无菌粉末或原料药,则MVD取1,可计算供试品的最小有效稀释浓度C:
λ/L。
4.1.1.3加样
将已充分溶解的待复核鲎试剂18支(管)放在试管架上,排成5列,其中4列4支(管),1列2支(管)。
4支(管)4列每列每支分别加入0.1ml的2λ、λ、0.5λ和0.25λ的内
毒素标准溶液;另2支(管)加入0.1ml检查用水。
4.1.1.4加样结束后,将鲎试剂用封口膜封口,轻轻振动混匀,避免产生气泡,连同试管架放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中,试管架保持水平状态,保温60±2分钟。
4.1.1.5观察并记录结果。
将试管架从水浴中轻轻取出,避免振动,将每管拿出缓缓倒转180°观察,管内形成凝胶,并且凝胶不变形,不从管壁滑脱者为阳性,记录为(+)
;未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性,记录为(-)。
4.1.2实验结果计算
如最大浓度2.0λ4管均为阳性,最低浓度0.25λ4管均为阴性,阴性对照为阴性时实验为有效,按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为
鲎试剂灵敏度的复核结果(λC)。
λC=lg-1(∑X/4)
式中X为反应终点浓度的对数值(1g)。
反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。
4.1.3结果判断
当λC在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格,可用于干扰实验和供试品细菌内毒素检查,并以λ(标示灵敏度)为该批鲎试剂的灵敏度。
4.1.4举例
设待复核鲎试剂的灵敏度为0.125EU/ml。
实验结果如下:
内毒素浓度 (EU/ml) 0.25 0.125 0.0625 0.031 Nc 反应终点浓度X
重 1
复 2
管 3
数 4 + + - - - 0.125
+ - - - - 0.25
+ + + - 0.0625
+ + + - 0.0625
λC=lg-1(∑X/4)
=lg-1[(lg0.125+lg0.25+lg0.0625+lg0.0625)/4]
=0.105(EU/ml)
λ在0.5λ-2λ范围内,符合规定。
并且使用该批鲎试剂时,其灵敏度为标示灵敏度0.105(EU/ml)。
4.2干扰实验
4.2.1操作方法
干扰试验的目的是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用,为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。
并且验证当供试品的配方和工艺有
变化,鲎试剂来源改变或供试品阳性对照结果呈阴性时供试品是否存在干扰作用。
由于干扰实验检验的是在供试品存在的情况下内毒素与鲎试剂的反应是否正常,与所使用鲎试剂的灵敏度无关,因此在干扰实验预实验中原则上可使用任一灵敏度的鲎试剂。
但
建议使用较低灵敏度(如0.5或0.25EU/ml)的鲎试剂,可尽量避免供试品所含的内毒素对干扰实验造成的阳性影响。
4.2.2干扰实验预实验
预实验的目的是初步确定供试品的最大不干扰浓度(当限值以EU/mg或EU/U活性单位表示)或最小不干扰稀释倍数(当限值以EU/ml表示),为正式干扰实验提供依据。
4.2.2.1将无可检测到内毒素的供试品进行一系列倍数的稀释,但最大的稀释倍数不得超过MVD=CL/λ0.03(0.03EU/ml为现今我国市售鲎试剂的最高灵敏度)。
4.2.2.2使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验。
每一稀释倍数下做2支供试品管和2支供试品阳性对照(即用该浓度的供试品稀释液将内毒素标准品制成2λ浓度)。
另取2支加
入细菌内毒素检查用水作为阴性对照,2支加入2λ浓度的内毒素标准溶液作为阳性对照。
供试品阳性对照制备举例:
制备稀释倍数为4的供试品阳性对照液方法,取0.3ml浓度为4λEU/ml的内毒素标准液+0.3ml的稀释倍数为2的供试品稀释液 制得0.6ml含2λ
EU/ml内毒素标准的稀释倍数为4的供试品稀释液。
保温60±2分钟后,观察并记录结果。
4.2.2.3当阴性对照为阴性,阳性对照为阳性时,实验为有效。
当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性,供试品阳性对照2管为阳性时,认为供试品在该浓度下不干扰实验,
此稀释倍数即为最小不干扰稀释倍数。
即可选择该稀释倍数进行正式干扰实验。
当系列浓度中所有浓度的供试品管都不为阴性,或供试品阳性对照不为阳性时,说明供试品对内毒素与鲎试剂的反应存在干扰,则应对供试品进行更大倍数稀释(不得超过MV
D=CL/λ0.03),或通过气压适宜的方法(如过滤、中和、透析或加热处理等)排除干扰。
当供试品的内毒素限值单位为EU/mg或EU/U活性单位时,应将最小不干扰稀释倍数换算成最大不干扰浓度(即该稀释倍数下溶液的浓度),以mg/ml或活性单位/ml表示。
4.2.2.4举例
例:
设某注射液限值为2.5EU/ml,按MVD=CL/λ计算出灵敏度为0.03EU/ml下的MVD为80倍,将供试品溶液稀释一系列检验,用灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂进行预实验。
结
果如下
稀释倍数原液510204080
供试品溶液------------
供试品阳性对照------++++++
如上结果可初步确定该样品的最小不干扰稀释倍数为20倍,可在此浓度下进行正式干扰实验。
4.2.3正式干扰实验
目的是检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。
使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过所使用的鲎试剂的最大有效稀释倍数的溶液。
4.2.3.1制备内毒素标准对照溶液
取1支细菌内毒素标准品,用细菌内毒素检查用水稀释成4个浓度的标准溶液即2.0λ、λ、0.5λ、0.25λ,(方法同4.1.1.1)。
4.2.3.2制备含内毒素的供试品溶液
4.2.3.2.1将供试品稀释至预实验中确定的不干扰稀释倍数,再用此稀释液将4.2.3.1中的同支细菌内毒素标准品稀释成4个浓度即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的含内毒素
的供试品溶液。
以注射用头孢哌酮钠(1g/瓶为例:
取10ml检查用水溶解注射用头孢哌酮钠即为100mg/ml,设需将其稀释20倍(5mg/ml)后备用。
(注:
冻干品或无菌粉末用检查用水溶解后
体积有无变化,根据具体情况定)。
取一支细菌内毒素标准品,加入1m检查用水溶解,然后取内毒素标准溶液0.3ml制备内毒素标准对照溶液;再取内毒素标准溶液0.3ml加上2.7ml的5mg/ml头孢哌酮钠溶液,即
为含10倍内毒素稀释液的供试品溶液,取0.3ml含10倍内毒素稀释液的供试品加上2.7ml的5mg/ml头孢哌酮钠溶液,即为含100倍内毒素稀释液的供试品溶液。
其余依次类推。
4.2.3.2.2简化法制备含内毒素的供试品溶液:
0.5ml浓度为1.0EU/ml的内毒素标准溶液+0.5ml浓度为10mg/ml的供试品溶液 得到1ml的含0.5EU/ml内毒素的浓度为5mg/ml的供试品液。
同理分别用0.5ml浓度为0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml的内毒素标准溶液制备含0.25EU/ml、0.125EU/ml和0.0625mEU/ml内毒素的浓度为5g/ml的供试品系列溶
液。
(其体积的大小视情况而定)。
4.2.3.3鲎试剂的准备
取规格为0.1ml/支的鲎试剂36支,轻弹瓶壁使粉末落入瓶底,用砂轮在瓶颈轻轻划痕,75%酒精棉球擦拭后启开备用,防止玻璃屑落入瓶内。
每支加入0.1ml检查用水溶解,轻
轻转动瓶壁,使内容物充分溶解,避免产生气泡。
若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时,按其标示量加入检查用水复溶,将复溶后的鲎试剂溶液混和在一起,然后每0.1ml分
装到10×75mm凝集管中,要求至少分装36管备用。
4.2.3.4加样
将准备好的鲎试剂18支(管)放在试管架上,排成5列,4列4支(管),1列2支(管)。
其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准
对照液,另一列2支(管)加入0.1ml检查用水作为阴性对照。
将另外18支(管)鲎试剂放在试管架上,排成5列,4列4支(管),1列2支(管)。
其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素的含供试
品溶液;另一列2支(管)加入0.1ml供试品溶液作为样品阴性对照。
加样结束后,用封口膜封口,轻轻振动混匀,避免产生气泡,两同试管架放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中,保温60±2分钟后,观察并记录结果。
4.2.4实验结果计算
如两组最大浓度2.0λ均为阳性,最低浓度0.25λ均为阴性,阴性对照4管均为阴性时,按下式计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值(ES)和用
供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均(Et)。
ES=lg-1(∑XS/4)
Et=lg-1(∑Xt/4)
式中
XS,Xt分别为用检查用水和供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值(lg)。
4.2.3当ES在0.5λ-2.0λ(包括0.5λ和2.0λ)时,且Et在0.5ES~52.0ES(包括0.5ES和2.0ES)时,则认为供试品在该浓度下不干扰试验,可在该浓度下对此供试品
进行细菌内毒素检查。
当ES不在0.5λ-2.0λ(包括0.5λ和2.0λ)时,则认为供试品在该浓度下干扰实验。
应使用适宜的方法排除干扰,如对供试品进行更大倍数稀释,是排除干扰因素的简单有效
方法。
建立新品种细菌内毒素检查方法时,每个厂家至少取三个批号(不包括亚批)的供试品,用两个以上鲎试剂生产厂家的鲎试剂进行干扰实验。
4.2.5举例
设供试品为某注射液,预实验
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