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α-酮戊二酸5.0mmol/L
修饰化Hcy甲基转移酶(HMTase)4.0KU/L
谷氨酸脱氢酶(GLDH)10.0KU/L
配方三:
S-腺苷甲硫氨酸盐(SAM)0.1mmol/L
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原性(NADH)0.2mmol/L
三(2羧乙基)磷氯化氢(TCEP)0.5mmol/L
修饰化Hcy甲基转移酶(HMTase)5.0KU/L
配方四:
S-腺苷甲硫氨酸盐(SAM)0.05mmol/L
三(2羧乙基)磷氯化氢(TCEP)0.3mmol/L
α-酮戊二酸6.0mmol/L
修饰化Hcy甲基转移酶(HMTase)15KU/L
R2试剂:
ph7.5
tris缓冲液100mmol/L
修饰化S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶2.5KU/L
腺苷脱氨酶4.0KU/L
修饰化S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶3.0KU/L
腺苷脱氨酶5.0KU/L
修饰化S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶3.5KU/L
腺苷脱氨酶5.5KU/L
1.2.1.2实验方法
按照以上配方分别进行试剂配制,并按产品标准的要求,用本公司生产的工作校准品和质控品按照以下方法进行检测。
比较各试剂的线性相关系数、分析灵敏度、准确性、精密度。
加入物
空白管
标准管
标本管
DH2O
13ul
标准
样本
R1
240ul
混匀,37℃温育5分钟
R2
65ul
加入R2混匀,温育180秒后,连续监测2分钟的吸光度变化值(△A/min)
1.2.1.3实验结果
R1R2配方组合
线性相关系数
分析灵敏度
准确性
精密度
R1
(一)R2
(一)
0.9835
0.012
5.90%
5.18%
R1
(二)R2
(一)
0.9877
0.014
4.99%
4.95%
R1(三)R2
(一)
0.9892
0.015
4.06%
4.76%
R1(四)R2
(一)
0.9916
0.013
3.45%
3.75%
R1
(一)R2
(二)
0.9943
0.019
2.91%
3.32%
R1
(二)R2
(二)
0.9960
0.025
2.86%
3.25%
R1(三)R2
(二)
0.9989
0.031
2.29%
2.21%
R1(四)R2
(二)
0.9971
0.026
2.55%
3.22%
R1
(一)R2(三)
0.9929
0.029
4.12%
3.84%
R1
(二)R2(三)
0.9938
0.016
4.26%
4.00%
R1(三)R2(三)
0.9902
0.022
4.72%
R1(四)R2(三)
0.9896
0.021
6.41%
6.04%
1.2.1.4实验结论
结果显示R1配方(三)与R2配方
(二)进行组合时试剂线性相关系数、精密度、准确性、分析灵敏度数值优于其他组合,因此基础配方R1试剂均按照配方(三)、R2试剂均按配方
(二)进行配制。
1.2.2试剂最适pH值的确定
1.2.2.1实验方案:
根据pH值对酶活性以及试剂反应速率的影响,R1和R2试剂设计了以下三种pH值:
R1试剂pH:
7.0、7.5、8.0
R2试剂pH:
7.0、7.5、8.0
分别按照基础配方配制三种不同pH值的R1和R2试剂,按照1.2.1.2的实验方法,比较各试剂的线性相关系数、分析灵敏度、准确性、精密度。
1.2.2.2实验结果:
R1pH
R2pH
7.0
0.9854
7.55%
6.72%
7.5
0.9917
4.10%
5.83%
8.0
0.9873
0.024
4.19%
0.9914
4.02%
3.73%
0.9988
0.030
2.58%
2.16%
0.9923
0.023
3.78%
4.42%
0.9903
4.13%
4.74%
0.9884
0.020
4.78%
5.04%
0.9810
0.018
6.02%
6.54%
1.2.2.3实验结论:
结果显示,当R1试剂的pH值为7.5和R2试剂的pH值为7.5时,试剂线性相关系数、精密度、准确性、分析灵敏度数值优于其他pH值;
因此,最后确定试剂R1试剂的pH值为7.5和R2试剂的pH值为7.5。
1.2.3稳定剂
1.2.3.1实验方案
稳定剂BSA主要用于试剂的保护。
在基础配方R1、R2加入不同浓度的稳定剂,其它原料按基础配方进行配制;
将R1、R2置于37℃水浴箱中,按照1.2.1.2的实验方法,分别在0小时、48小时、96小时、144小时进行检测,比较各试剂的分析灵敏度的变化。
基础配方R2稳定剂的浓度分别按0g/L、0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L进行配制。
1.2.3.2实验结果
稳定剂浓度
0小时
48小时
96小时、
144小时
0g/L
0.5g/L
1.0g/L
0.028
1.5g/L
1.2.3.3实验结论:
结果显示当稳定剂的浓度为0.5g/L时,试剂分析灵敏度数值优于其他浓度;
同时实验显示,稳定剂的浓度过高,会影响试剂的灵敏度。
因此,最后确定试剂R1、R2加入稳定剂的最佳浓度为0.5g/L。
1.3最终的试剂配方
R1试剂(每1000ml)pH7.5
主要原材料
来源
浓度
质量
tris
Amresco公司
100mmol/L
12.11g
HCl
北京化工厂
/
S-腺苷甲硫氨酸盐
Sigma公司
0.1mmol/L
43.49mg
NADH
Amano公司
0.2mmol/L
141.88mg
TCEP
0.5mmol/L
143.13mg
α-酮戊二酸
5.0mmol/L
730.5mg
修饰化Hcy甲基转移酶
ASAHI公司
5.0KU/L
谷氨酸脱氢酶
Toyobo公司
10.0KU/L
纯化水
自制
定容至1000ml
R2试剂(每1000ml)pH7.5
1mol/L
修饰化S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)
水解酶
腺苷脱氨酶
3.0KU/L
BSA
Roche
0.5g
以上数据均是参考“PastoreA,MassoudR,MottC,etal.Fullyautomatedassayfortotalhomocysteine,cysteine,cysteinylglycine,glutathione,cysteamine,and2-mercaptopropionylalycineinplasmandurine.ClinChem,1998,44(4):
825-829”文献中的有关资料,经过反复多次实验,最终确定的数据。
1.4主要生产工艺描述
见附件一:
生产工艺流程图
2.反应体系的组成
2.1反应体系组成:
反应体系主要由R1试剂、R2试剂、校准品、产品使用说明书等几部分组成。
2.2试剂规格:
根据不同客户、不同仪器的要求。
我们开发了以下几种规格的试剂:
R1-11ml
R2-3ml
R1-17.5ml
R2-4.5ml
R1-22ml
R2-6ml
R1-33ml
R2-9ml
R1-2×
33ml
R2-2×
9ml
R1-66ml
R2-18ml
66ml
18ml
R2-18ml
R1-4×
18ml
R1-8×
11ml
R2-8×
3ml
2.3校准品含量:
每批定值。
3.被测样本的要求
样本为新鲜血清或血浆(肝素抗凝)。
请采血后立即离心分离血浆,或冷藏保存1小时内分离,离心后的样本在室温下可稳定4天,0℃~2℃可稳定数周,-20℃下可稳定数月或数年。
4.试剂用量
4.1试剂用量的确定
4.1.1实验方案:
试剂用量的确定主要是R1与R2试剂配方一定的条件下,二者加入比例的确定。
实验方法:
样本加入量为13ul,R1与R2试剂加入量分别按165ul:
140ul、195ul:
105ul、235ul:
75ul、240ul:
65ul、250ul:
55ul。
按配方配制R1与R2试剂,并按产品标准的要求,用本公司校准品和质控品按照以下方法进行检测。
4.2.2实验结果
R1:
165ul:
140ul
0.9767
6.16%
7.05%
195ul:
105ul
0.9856
5.43%
235ul:
75ul
0.9924
3.24%
3.55%
240ul:
250ul:
55ul
0.9932
0.011
3.33%
4.58%
4.2.3实验结论:
结果显示,试剂加入比例R1:
R2为240ul:
65ul时,试剂线性相关系数、精密度、准确性、分析灵敏度数值优于其他比例;
因此,最后确定试剂加入比例R1:
65ul。
4.2样本加入量的确定:
4.2.1实验方法:
取配制合格的R1、R2试剂,用企业内部校准品、质控品进行检测,样本使用量分别按10ul、13ul、16ul、19ul进行,R1、R2试剂加入量分别为240ul、65ul;
按照1.2.1.2的实验方法,比较各样本加入量的相关系数、分析灵敏度、准确性、精密度。
样本加入量
10ul
2.75%
4.25%
0.9986
2.14%
2.41%
16ul
0.9945
3.06%
3.88%
19ul
0.9910
5.26%
结果显示样本加入量为13ul时,试剂线性相关系数、精密度、准确性、分析灵敏度数值优于其他样本加入量;
因此,最后确定样本加入量为13ul。
样本加入量:
R1:
R2=13μl:
240μl:
65μl
注:
样本、R1、R2的加入量可按比例进行放大和缩小。
5.体系的反应条件
5.1体系反应温度:
37℃
5.2测定波长:
主波长340nm
副波长700nm
样本中的同型半胱氨酸被转化为游离型后,通过与共价底物反应,产生腺苷。
NADH在340nm下有最大吸收,因此测定波长定在340nm。
5.3比色杯光径:
1cm
5.4反应时间:
5.4.1样本与R1混匀后温浴时间的确定
5.4.1.1实验方案
将样本与R1混合,分别置于37℃下温浴0分钟、1分钟、3分钟、5分钟、7分钟,按照1.2.1.2的实验方法进行检测,比较样本与R1混匀后温浴时间对试剂线性相关系数、精密度、准确性、分析灵敏度数值的影响。
5.4.1.2实验结果
样本与R1温浴时间
0分钟
0.9894
3.14%
2.60%
1分钟
0.9973
2.61%
2.83%
3分钟
0.9974
2.43%
5分钟
0.9983
2.24%
2.31%
7分钟
0.9948
2.49%
3.48%
5.4.1.3实验结论:
结果显示当样本与R1混匀后不进行温浴时,由于样本中的杂质干扰,试剂相关系数、分析灵敏度、准确性、精密度明显偏低。
而样本与R1混匀后温浴1-5分钟时,试剂相关系数、分析灵敏度、准确性、精密度明显比较理想;
因此,最后综合考虑,确定样本与R1混匀时间为1-5分钟。
5.4.2吸光度测定时间的确定
5.4.2.1实验方案
将样本与R1混合,分别置于37℃下温浴5分钟,然后加入R2,按照1.2.1.2的实验方法进行检测,观察吸光度数值随时间的变化。
5.4.2.2实验结果
5.4.2.3实验结论:
结果显示:
至少在180秒内吸光度数值成线性关系。
因此确定样本加入R2,温育3分钟然后在340nm下连续测定2-3分钟内各管吸光度变化值。
5.4.3反应时间的最终确定:
样本与R1温育1-5分钟后加入R2,温育3分钟后在340nm下连续测定2-3分钟内各管吸光度变化值。
6.体系的有效性确定方法
6.1仪器:
检验用仪器必须经过检定,并且在有效期内使用。
6.2用在研究开发过程中所选择的原材料,按照生产工艺的要求,小批量生产三批产品,按照企业标准的要求,分别用企业内部校准品和质控品进行检测,结果均应符合标准的要求。
6.3严格按照所确定的体系反应条件进行检测。
7.有关验证资料
7.1工艺验证方案
7.2工艺验证报告
7.3设计开发验证方案
7.4设计开发验证报告
7.5内包材验证方案
7.6内包材验证报告
附件一:
称量、配制▲
工艺用水制备
分装
试剂瓶准备
入成品仓库
10万级洁净车间
▲关键工序
- 配套讲稿:
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- hcy 生产工艺 研究