吸入异氟烷对大鼠肺表面活性蛋白ASPA影响详解Word文件下载.docx
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3.支气管肺泡灌洗液(BALF)中SP-A的含量:
0.7%Iso组中4hr亚组外,各吸入异氟烷组大鼠的BALF中SP-A的含量均较Con组显著下降(p<
0.01);
1.5%Iso组和2.0%Iso组中8hr亚组较0.7%Iso组8hr亚组下降更明显(p<
0.01)。
各组内不同亚组间的比较可见:
0.7%Iso组中8hr、10hr亚组较Con组明显下降(p<
0.01),但两亚组间无明显差别;
1.5%Iso组与2.0%Iso组中各亚组均明显低于Con组(p<
0.01),各亚组间也未见明显区别。
4.免疫组化检测肺Ⅱ型上皮细胞中SP-A的含量:
1.5%Iso组与2.0%Iso组肺泡Ⅱ型上皮细胞中SP-A的含量明显下降,而0.7%Iso组较Con组无明显变化。
5.肺组织匀浆中的SP-AmRNA含量:
吸入异氟烷的各组中,0.7%Iso组SP-AmRNA的含量与Con组、40%O2组均无明显差异;
1.5%Iso与2.0%Iso组中4hr、8hr亚组SP-AmRNA的表达均明显低于Con组、40%O2组和0.7%Iso组中相应的亚组,有统计学差异(p<
0.01),各组的10hr亚组均恢复至Con组水平。
结论吸入1.5%或更高浓度的异氟烷4小时以上,可降低大鼠肺组织SP-A的基因表达和蛋白合成,并可能影响其分泌和再摄取。
停止吸入异氟烷2小时后,大鼠肺组织SP-A的基因表达可恢复至正常水平,但蛋白合成需更长时间才能恢复。
[关键词]异氟烷;
肺表面活性蛋白-A(SP-A);
基因表达
异氟烷(isoflurane,Iso)由于具有安全、低毒和可控性好等优点,而成为目前临床最常用的吸入麻醉药。
但是,其对呼吸系统,尤其是对肺泡上皮细胞的不良影响也已为人们所重视。
有动物实验表明,异氟烷可以降低肺表面活性物质(pulmonarysurfactant,PS)的合成(包括磷脂和蛋白),增加肺部的炎性反应并降低肺部的防御机制,[1-5] 是引起术后肺部并发症(如肺不张、肺部感染等)的影响因素之一。
而肺表面活性蛋白-A(surfactantproteinA,SP-A)是肺表面活性物质中含量最多,与PS的合成和分泌密切相关的一种蛋白质,并对PS的生理功能和肺自我防御机制起到重要作用[6-7]。
有研究表明,大鼠吸入较高浓度异氟烷时,支气管肺泡灌洗液中的SP-A浓度下降。
[8]异氟烷还可使培养的正常Ⅱ型肺泡上皮细胞内和培养液中SP-A的含量降低。
[5] 然而,吸入异氟烷引起上述改变发生在哪一水平,目前还未见明确报道。
因此,本实验研究拟通过检测吸入不同浓度异氟烷大鼠的支气管肺泡灌洗液(broncho-alveolarlavagefluid,BALF)和肺组织中SP-A的含量,以及肺组织中SP-AmRNA含量的变化,来探讨异氟烷对肺内SP-A的合成、分泌与基因表达的影响。
材料与方法
(一)实验动物:
健康成年Wistar大鼠104只,体重200±
10g,由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供,于北京大学人民医院实验动物中心(SPF级)预检7-10天,六只一笼饲养,动物室和实验室温度为23oC,12h明暗轮流光照,自由饮食。
(二)试剂与药品:
异氟烷(美国雅培制药有限公司)
戊巴比妥钠(德国默克制药公司)
40%Acrylamide(丙烯酰胺:
N,N’-双丙烯酰胺=29:
1,美国Bio-Rad公司);
N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED,美国Promega公司);
标准分子量蛋白(ProteinMolecularMarkers,美国Biolab公司);
标准浓度蛋白(美国Promega公司);
蛋白分析液(美国Bio-Rad公司);
Tween-20(美国Bio-Rad公司);
苯甲磺酰氟(PMSF,美国Sigma公司);
正钒酸钠(SodiumOrthovanadate,NaVO4,美国Sigma公司);
抑肽酶(Aprotinin,美国Sigma公司);
ECL化学发光试剂盒(英国Amersham公司);
兔抗SP-A多克隆抗体(美国SantaCruz公司,工作浓度1:
200)
辣根过氧化物酶结合羊抗兔多克隆抗体(美国SantaCruz公司,工作浓度1:
2000);
LSAB试剂盒(丹麦Dako公司);
RNA提取试剂(Trizol,美国Promega公司);
TBE5×
(上海生工生物工程技术服务有限公司);
Oligo(dT)15、M-MLV逆转录酶(美国Promega公司);
Rnasin(日本Toyobo公司);
焦磷酸二乙酯(DEPC,美国Sigma公司);
2×
TaqPCRMasterMix(包含TaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl2,浓度为2×
)(北京天为时代公司);
核酸分子量参照物:
DNAmarkerⅡ(北京天为时代生物科技有限公司);
琼脂糖(购自北京鼎国生物有限公司);
(三)主要仪器:
Narcomed2B麻醉机(Drager公司)
机玻璃麻醉箱(40cm×
30cm×
30cm)(北京有机玻璃厂)
气体监测仪(Datex-Ohmeda,芬兰)
低温高速离心机(Sigma公司、Eeppendoff公司)
恒温水浴锅(哈尔滨东方电控开关厂)
VM-1000型涡旋振荡器(UpwardsBiosystems公司)
10kD离心超滤管(美国Millipore公司)
MiniIIPROTEAN稳压稳流型电泳仪(美国Bio-Rad公司);
石墨转移电泳仪(北京科普仪器厂);
紫外/可见分光光度计(日本SHIMADZU公司);
-80℃低温冰箱(日本SANYO公司);
TN型托盘式扭力天平(上海第天平仪器厂);
AEU-20电子天平(德国Siemens公司);
300℃烤箱(天津市实验仪器厂);
DT-100光电天平(北京光学仪器厂);
台式高速离心机(上海医用分析仪器厂);
HybondPVDF膜(美国Amersham公司)
MOS-1水平摇床(北京Beide公司);
X光胶片(美国Kodak公司);
组织切片机(德国Leitz公司);
双目显微镜(日本Olympus公司);
PCR仪(德国Eppendorf公司)
(四)实验方法:
1.实验动物分组:
雄性Wister大鼠104只随机分为5组:
组2,40%O2对照组(40%O2,n=24);
2.检测指标和方法
2.1肺组织的取材和固定实验结束后取出试验大鼠,麻醉(1g/L戊巴比妥钠,40mg/kg,)后,采用14号套管针外套管行气管插管,放血活杀。
从每只大鼠右上肺叶切取约2mm3肺组织,3%戊二醛固定。
超薄切片,透射电镜观察。
其余右上肺叶,4%甲醛固定,石蜡包埋、切片。
另外3叶右肺组织-70℃冻存备用。
2.2检测BALF中SP-A的浓度(WesternBlotting)按照参考文献[9-10]的方法收集肺泡灌洗液。
大鼠放血活杀后,于肺门处结扎右主支气管,自气管插管缓慢向左侧肺内注入生理盐水(4℃预冷)12ml/kg,注毕,使液体在肺内停留30秒,然后放平注射器,抬高大鼠下半身,借重力收集肺泡内灌洗液体,重复3次。
将3次所得灌洗液收集汇总,记录总量,计算灌洗回收率,总回收率为80%左右。
将BALF于4℃、1000rpm离心10min,去除细胞和杂质。
上清液经超滤(超滤管Millipore,USA)浓缩约10~15倍。
Follin酚法测定蛋白浓度,加入上样缓冲液,配制样品的终浓度为1μg/μl,按每泳道40μl样品上样,10%聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳(Biorad,USA)。
WesternBloting法对SP-A进行免疫印记分析,一抗为兔抗SP-A多克隆抗体(SantaCruz,USA),辣根过氧化物酶标记二抗,化学发光(二抗与发光液,SantaCruz,USA),曝光X光片,将X光片上的条带数字化,并进行统计分析。
2.3检测肺泡Ⅱ型上皮细胞中的SP-A含量(immunohistochemistry,IHC)取右上肺组织石蜡切片,经脱蜡、H2O2封闭。
采用兔抗SP-A多克隆抗体(SantaCruz,USA)4℃过夜。
二抗及显色系统应用免疫组化试剂盒(中杉公司),DAB显色后于光镜下观察,结果以胞浆内可见棕红色颗粒者为阳性,并按下列标准判断:
(-)为不着色或呈背景颜色;
(+)为弱阳性,细小显色颗粒,数量稀少;
(+++)为强阳性,粗大显色颗粒,数多密集;
(++)为表现介于(+)和(+++)之间。
[11]
2.4肺组织内SP-AmRNA含量(RT-PCR)取-70℃冻存的肺组织50μg,总RNA提取用酸酚一步法(试剂为Trizol,Invitrogen,USA)。
采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)(逆转录酶M-MLV,Promega,USA;
Taq酶2×
buffer,Tiangen,北京)方法测定SP-AmRNA相对含量。
GAPDH作为内参照。
PCR产物经2%琼脂糖凝胶(含EB)电泳,于紫外灯下可见清晰条带,扫描并行图象和分析。
引物序列[12-14]:
SP-A上游5’-atgtcactgtgttctttggccttc-3’下游5’-tcaaaattcacaaacagccagcc-3’;
GAPDH上游5’-gggcagcccagaacatcatcc-3’下游5’-ccagccccagcatcaaaggtg-3’。
SP-A、GAPDH扩增产物为747bp、298bp。
(五)统计方法:
实验数据以SPSS13.0软件包处理,以均数标准差(xs)表示。
计量资料采用单因素方差分析和LSD法两两比较,P<
0.05为差异有统计学意义。
结果
2.形态学观察(表1):
对照组可见正常肺泡结构正常,电镜下见肺泡Ⅱ型上皮细胞附于肺泡壁,细胞器清晰,肺泡腔侧见大量板层体,板层体出胞现象多见。
0.7%Iso组在光镜和电镜下均与对照组差异不大,但板层体出胞现象较少见。
1.5%Iso组与2.0%Iso组的多数切片在光镜下与对照组差异不显著,但少数切片可见肺泡隔增宽、炎性细胞浸润以及肺泡腔中渗出增加等病理现象;
而在电镜下可见肺泡Ⅱ型上皮细胞变形、脱落,细胞器肿胀模糊,板层体排空或空泡样变等。
3.大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中SP-A含量(表2):
氧气对照组(40%O2组)中各亚组BALF中SP-A含量均与空白对照无差异。
吸入异氟烷各组除0.7%Iso-4hr亚组外,BALF中SP-A的含量均较空白对照组和同时点氧气对照组(40%O2组中各亚组)有显著下降(p<
1.5%Iso组和2.0%Iso组的8hr、10hr亚组与0.7%Iso组的8hr、10hr亚组分别相比,BALF中SP-A的下降更为明显,组间比较有显著性差异(p<
4.免疫组化检测肺组织中SP-A表达的变化(表3):
Con组大鼠肺组织内SP-A表达丰富,分布于肺泡Ⅱ型细胞、支气管上皮细胞及部分肺泡巨噬细胞内,呈棕黄红颗粒,肺泡及细支气管腔内也有一薄层棕红色物质。
40%O2组与Con组和0.7%Iso组中各亚组均与对照组无明显差异;
1.5%Iso组、2.0%Iso组8hr亚组大鼠肺泡Ⅱ型细胞内的SP-A表达比对照组明显减弱。
按前述判断标准进行评定,结果见表5。
5.大鼠肺组织SP-AmRNA表达(表4):
SP-AmRNA的表达以SP-AmRNA与GAPDHmRNA表达量的比值表示。
与空白对照组相比,40%O2组和0.7%Iso组的表达量无明显差异;
1.5%Iso组和2.0%Iso组4hr、8hr大鼠肺组织SP-AmRNA均较同时点40%O2对照显著下降(P<
0.01),但10hr亚组可以恢复到空白对照水平。
讨 论
肺表面活性蛋白(surfactantprotein,SP)是肺表面活性物质的重要组成成分,其含量约占肺表面活性物质总量的10%。
根据其分子结构,可分为亲水性的SP-A、SP-D和疏水性的SP-B、SP-C。
其中SP-A是肺表面活性物质中含量最多的一种的糖蛋白,分子量为28-36kD[15,16,17],主要存在于肺泡Ⅱ型上皮细胞内和肺泡膜表面。
目前已发现SP-A的生理作用包括三方面:
①参与磷脂的表面活性功能:
结合磷脂,尤其是DPPC;
促进板层体(LamellarBody,LB)转化为管髓体(TM);
促进磷脂单分子层的形成并维持其稳定;
限制血浆蛋白进入肺泡腔等。
[6-7]②维持PS的动态平衡:
调节LB的分泌;
增强肺泡Ⅱ型上皮细胞对脂质的摄取等[18]。
③免疫及免疫调节作用:
粘附、结合并灭活多种病原微生物;
直接抑菌作用;
抵抗变应原及抑制肺部超敏反应;
抗原呈递及调理T细胞和巨噬细胞,提高巨噬细胞的趋化性;
调控肺部炎症反应;
抑制脂质过氧化等。
[19]由于SP-A具有上述重要生理功能,因此,SP-A质和量的改变与许多肺部疾病的发病密切相关,例如,在急性肺损伤(ALI)、ARDS、COPD及哮喘时,SP-A的含量均明显降低。
而SP-A基因敲除小鼠则会因为严重肺部感染和剧烈的炎症反应而死亡。
[20] 因此,SP-A作为肺损伤的指标已日益受到重视,最近还有人提出将BALF和血清中SP-A的含量,用作预测ARDS等重症患者预后的指标之一。
[21]
我们研究的结果显示:
①吸入40%O210小时未影响大鼠BALF、肺组织中SP-A的含量,也未改变肺组织中SP-A的基因表达。
既往的研究显示,长时间吸入纯氧可以降低肺表面活性物质的合成,[22]但通常认为长时间吸入40%O2没有明显影响。
本实验结果显示,吸入40%O210小时未改变大鼠肺SP-A的表达。
②短时间(4小时)吸入异氟烷,浓度为0.7%时,大鼠BALF中的SP-A含量较同时点40%O2对照组无明显改变;
但吸入浓度为1.5%或2.0%时,BALF中的SP-A含量明显降低。
长时间(8小时)吸入异氟烷浓度为0.7%、1.5%或2.0%时,均可使大鼠BALF中的SP-A含量明显下降,1.5%Iso组和2.0%Iso组与0.7%Iso组相比下降更为明显。
停止吸入异氟烷2小时后,三组大鼠BALF中的SP-A含量均未恢复。
可见,短时间、吸入低浓度的异氟烷则不会造成肺泡腔中的SP-A的含量下降,但长时间吸入高浓度异氟烷会使之降低,并且在停药后2小时内无法恢复。
③肺组织内的SP-A含量则显示出更明显的异氟烷的浓度依赖性。
吸入异氟烷浓度为1.5%或2.0%时,肺组织内的SP-A含量明显下降,4hr亚组和8hr亚组间无明显差别,停药后2小时可部分恢复,但未恢复至正常水平。
吸入0.7%异氟烷时,仅8hr亚组肺组织SP-A水平轻微下降(与空白对照的差异有显著性,但与4hr亚组的差异无显著性),并在停药2小时内完全恢复。
④免疫组织化学染色结果显示肺泡Ⅱ型上皮细胞内SP-A含量的变化趋势与③一致。
⑤肺组织中SP-AmRNA的含量也呈现与吸入异氟烷浓度相关的下降趋势。
0.7%Iso组4hr、8hr亚组虽与对照组之间无明显差异,但出现下降趋势;
1.5%Iso组和2.0%Iso组较对照组下降明显,组内4hr、8hr亚组间无明显差别。
各组的10hr亚组中肺组织SP-AmRNA含量均恢复至与正常对照无显著差异。
可见,在本研究中SP-AmRNA含量、组织中SP-A含量和BALF中的SP-A含量均呈现出明显的随吸入异氟烷浓度增高而降低的趋势,基本可以反映SP-A的基因表达、蛋白合成以及分泌到肺泡腔中的SP-A的含量的变化趋势。
但各项指标的变化并不平行,BALF中的SP-A含量改变似乎对异氟烷最敏感,0.7%Iso组8hr亚组即可见明显下降,而此条件下细胞内SP-A、SP-AmRNA含量并未出现明显变化。
这种不平行变化的原因可能与SP-A的合成、分泌过程的各个环节有关。
SP-A主要由肺泡Ⅱ型上皮细胞合成。
SP-A基因在核内转录形成的mRNA在核周和胞浆完成翻译。
翻译产物(SP-A前体)在内质网进行剪切和修饰后,部分进入Golgi复合体继续加工并移入板层体(LB),与表面活性物质中的磷脂成分以及被Ⅱ型细胞内吞并重复利用的表面活性物质结合后[23,24],以板层体出胞的形式分泌到肺泡腔中。
这种分泌方式因受到神经内分泌及旁分泌等多种因素的调控,称调控分泌。
而另一部分未进入LB的SP-A则直接由胞浆分泌出胞,称持续分泌。
持续分泌较少受到此类因素干扰。
[23-25] 电镜下0.7%Iso组肺泡Ⅱ型上皮细胞的形态结构、细胞器和LM的数量与对照组均无明显差别,唯有LM出胞现象较少见。
这也可视为Ⅱ型细胞调控分泌减少的证据之一。
故此我们推论,吸入低浓度异氟烷(0.7%Iso组)时,大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞内SP-A的合成无明显变化,而BALF中SP-A明显下降的主要原因是由于Ⅱ型上皮细胞对SP-A的分泌减少所致。
在中(1.5%)、高(2.0%)浓度异氟烷组BALF与细胞内SP-A含量以及组织中SP-AmRNA的表达均可见明显下降。
电镜研究也显示,1.5%Iso、2.0%Iso组大鼠肺泡Ⅱ型细胞内板层体明显减少、排空或空泡样变性,甚至部分肺泡Ⅱ型细胞肿胀、脱落,细胞器模糊不清。
因此,长时间吸入中、高浓度异氟烷时,SP-A的合成下降,与既往的细胞学研究结论一致。
[5,8] 并且这一影响至少发生在基因转录的水平,致使作为转录产物的SP-AmRNA含量下降,继而使SP-A的合成降低。
同时,本研究还发现同一浓度组的不同亚组间,虽然各项指标在不同时间点的反应不尽相同,但时间依赖性并不明显。
吸入中(1.5%)、高(2.0%)浓度异氟烷时,无论短时间(4小时)还是长时间(8小时)SP-A的基因表达水平、蛋白合成和分泌均下降,且亚组间比较无显著差异。
吸入低浓度(0.7%)异氟烷时,短时间(4小时)内各项指标均无明显变化,而长时间(8小时)则可见SP-A的合成和分泌有下降趋势,但本实验仅观察到一个时间点的变化,尚无法判断其是否会随吸入异氟烷的时间增加而继续下降。
因此,我们认为吸入中(1.5%)、高(2.0%)浓度异氟烷8小时以内,异氟烷对SP-A的基因表达及蛋白合成的抑制作用并不会随时间延长而加重。
从而推测异氟烷可能使肺泡Ⅱ型上皮细胞中SP-A的基因表达与蛋白合成下调到某一水平,并在一定时间内保持稳定,而非不可逆性的破坏作用。
停止吸入异氟烷后,SP-A的基因表达最先恢复,蛋白合成水平在停药2小时后部分恢复,而肺泡腔中的SP-A水平则在停药2小时后仍未见恢复。
可见,SP-AmRNA水平是判断SP-A表达水平最敏感、反应最快的指标。
因此,我们推测吸入中(1.5%)、高(2.0%)浓度的异氟烷对大鼠肺内SP-A的影响是发生在肺泡Ⅱ型上皮细胞的基因转录水平的,由于吸入异氟烷降低了SP-AmRNA转录,继而使Ⅱ型细胞合成SP-A下降。
但异氟烷仅是将肺泡Ⅱ型上皮细胞中SP-A的基因表达与蛋白合成下调,而非不可逆的损伤,并能在一定时间内保持稳定。
这也可能是在停止吸入异氟烷后,SP-AmRNA含量可以迅速恢复的原因之一。
异氟烷如何调节SP-A的基因表达,目前尚不清楚。
因SP-A的表达调控机制极为复杂,其中涉及多种激素、细胞因子及一系列转录因子等。
它们通过作用于DNA序列中的多个元件,而达到上调或下调基因表达的作用,其中任何一项的变化都会改变SP-A的基因表达水平。
[3,24]吸入异氟烷对肺部的影响已有许多研究,其中加重肺组织的炎性反应,减少肺表面活性物质的合成,以及DNA损伤、蛋白质氧化、脂质过氧化等[5,26]可能与SP-A的表达下调有关。
Kotani等[3]曾发现,异氟烷等卤代麻醉药能增加来源于肺巨噬细胞的前炎症细胞因子,如TNF-α的表达。
TNF-α可通过转录因子NF-κB介导的调节作用,使细胞内SP-AmRNA含量减少,并抑制SP-A的合成。
[27]Osanai等[24]通过对原代培养的肺泡Ⅱ型上皮细胞的研究发现,分泌到培养介质中的SP-A主要是新合成的,而聚集在板层体中的SP-A是由肺泡Ⅱ型上皮细胞从细胞外摄入的。
这一发现与SP-A参与调节磷脂回收和再利用有关。
最近Kim等[28]报道,大鼠吸入1%的异氟烷60分钟后,淋巴细胞、骨髓、肺脏、肝脏等组织中DNA损伤和蛋白质氧化增加。
但同时有研究表明,SP-A具有调节肺炎性反应和抑制脂质过氧化等作用,即SP-A含量及功能的下降有可能加剧肺部炎症反应、磷脂的破坏,从而使肺损伤更加恶化。
[29]由此可见,一些能够改变SP-A基因表达的因素,往往也受到SP-A的调节,呈现出错综复杂、互相调控的关系。
因此要了解异氟烷下调SP-AmRNA表达的确切途径,还需进一步深入研究。
综上所述,吸入低浓度(0.7%)的异氟烷对大鼠SP-A的基因表达和蛋白合成影响较小,但长时间(8小时)吸入有可能降低肺泡Ⅱ型上皮细胞对SP-A的分泌,而使BALF中的SP-A含量下降。
中(1.5%)、高(2.0%)浓度的异氟烷明显抑制了大鼠SP-A的基因表达、合成和分泌,致使肺组织中SP-AmRNA、肺泡Ⅱ型上皮细胞中SP-A以及BALF中的SP-A含量均明显下降。
但这一过程是可逆的,停止吸入异氟烷2小时SP-A的基因表达可恢复至正常水平,其合成与分泌的恢复需要更长时间。
异氟烷对大鼠肺SP-A的影响发生在基因转录水平,其确切机制尚需进一步研究。
结论
1.吸入临床相关浓度(1.5%或更高浓度)的异氟烷4小
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