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摘要
研制出一种基于壳聚糖/石墨烯有机—无机复合膜作为固定基质的酶生物传感器。
将壳聚糖、石墨烯、辣根过氧化物酶混合均匀后,用滴涂法将混合溶液滴到已经打磨光滑且干净的金电极表面晾干后制得复合膜电极.使用循环伏安法(CV)和计时电流法(I—T),用对苯二酚作为电子传递体实现对过氧化氢的灵敏测定,其响应电流与过氧化氢的浓度在2。
50×
10-6mol.L-1~2.0×
10-3mol。
L—1范围内呈线性关系,线性相关系数R=0。
9985,检测限5.88×
10-8。
研究了各种实验条件对复合膜电极性能的影响。
该复合膜电极制作简单,稳定性好、使用寿命长,电极使用半个个月后其响应电流仍能保持初始值的90。
34%。
关键词:
壳聚糖;
辣根过氧化物酶;
石墨烯;
过氧化氢;
对苯二酚
Abstract
PreparedasimplehydrogenperoxidebiosensorbasedonChitosan/GrapheneInorganic-Organiccompositematrix。
Tomixchitosan,graphene,horseradishperoxidaseevenly,thendripthemixedsolutionontoAuelectrodesurfacethathasbeenpolishedsmoothlyandcleanly,Afterdryingtopreparethecompositefilmelectrode。
Usingcyclicvoltammetry(CV)andchronoamperometry(I—T),Madehydroquinoneastheelectrontransfertomeasureofhydrogenperoxidemoresensitively。
Thelinearrangewas2。
50×
10-6to2×
L-1,thelinearcorrelationcoefficientR=0.9985,thedetectionlimitwas5.88×
10-8.wehavestudiedtheeffectsofvariousexperientalconditionsontheperformanceofcompositemembraneelectrode。
Thecompositefilmelectrodehastheadvantagesofsimplemanufacture,goodstability,longservicelife,theresponsecurrentofthesensordecreased90。
34%afterstoring15days.
Keyword:
Chitosan;
horseradishperoxidase;
graphite;
Hydrogenperoxide;
hydroquinone
第一章前言
1。
1电化学酶传感器
按测量信号不同,电化学酶传感器又可分为电流型、电位型和电导型。
电流型酶传感器的原理是利用固定在电极表面上的酶对酶底物的催化氧化或还原,产生可在电极上还原或氧化的组分,获得电流信号(有时这一过程需要外加电活性媒介)[1];
电位型传感器是基于离子选择性电极原理而发展起来的,固定到电极表面的酶对底物催化,产生离子型物质,能引起指示电极电位改变,电位变化关系遵循Nernst方程[2];
电导型传感器是利用酶催化底物反应,导致反应体系中离子种类及浓度的变化,从而引起溶液导电性的改变,以溶液电导率为响应信号。
酶传感器的研究经历了三个发展阶段,即以酶的天然介体-氧来沟通酶与电极之间的电子通道,直接检测酶反应底物的减少或产物的生成的第一代传感器;
基于人工合成的媒介体来代替氧沟通酶的活性中心与电极之间的电子通道,通过检测媒介体的电流变化来反映底物浓度的变化的第二代酶生物传感器和利用酶自身与电极间的直接电子转移来完成信号转换的无媒介体存在的第三代酶生物传感器[3]。
1.1过氧化物氢生物传感器的概述
H2O2的测定主要有容量分析法、光谱法、电化学法等[4-8],其中电化学方法因具有快速、直接、可在线分析等优点而得到广泛关注,各种H2O2生物传感器的制备也得到广泛报道,辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)对H2O2分解具有高的选择性和催化活性,但由于其分子质量大,难于实现酶活性中心与电极表面间的直接电子传递。
因此,HRP传感器的性能决定于酶在电极表面的构筑。
已报导的HRP固定方法较多,如戊二醛交联法、共价键合法、溶胶一凝法、聚合物包裹法、吸附法、纳米金溶胶、碳纳米管以及5102纳米粒子固定法等。
由于强化学键可能导致酶的失活,而溶胶—凝胶的酸碱度不易调至中性,在凝胶过程中可能导致修饰膜的干裂脱落.此外,由于HRP的氧化还原活性中心深埋在酶分子内部,在通常情况下难以与电极之间进行直接电子转移。
这些情况都直接影响酶的固定和酶催化活性的长时间保持.
张晓蕾等[9]以纳米金/壳聚糖/碳纳米管修饰HRP构筑了过氧化氢传感器.ZhaoYuandi等[10]将纳米金吸附HRP直接吸附在碳纳米管上,制成碳纳米管修饰电极,并研究HRP在电极上的直接电化学行为。
XiaoYi等[11]将HRP自组装到纳米金/半胱胺修饰的金电极上构制了第三代HRP生物传感器.YuRuqin等[12]将HRP固定在纳米金修饰的壳聚糖碳糊电极表面构制了HRP生物传感器.ShiAiwu等[13]将HRP吸附在纳米金/聚硫堇纳米线修饰的玻碳电极表面制备了新型HRP传感器.
1.2化学修饰电极的制备、表征及应用
化学修饰电极就是用化学或物理的方法将某些特定功能团或化合物修饰在电极表面,从而改变或改善电极原有的性质,实现电极的功能设计[14].化学修饰电极的制备,其修饰方法是非常关键的,它影响到电极的性能,不仅包括重现性和稳定性,而且影响到它的实际应用。
电极表面的修饰方法依其类型、功能和基底材料的性质和要求而不同。
目前已经发展了许多不同的方法来制备化学修饰电极,董绍俊等[15]详细介绍了化学修饰电极的制备和类型。
1。
2.1电极的预处理
在制备化学修饰电极之前,首先要对基底电极表面进行清洁处理,然后再进行修饰电极的制备。
处理的方法包括:
a物理处理:
即是对固体电极首先进行机械研磨及抛光,通常是把基底电极依次在粒度从大到小的抛光剂中进行研磨.每次抛光后先洗去表面污物,再用稀酸、稀碱、乙醇和纯水超声清洗2—3min,直至清洗干净。
如果电极表面存在惰化层和很强的吸附层时,必须用机械或加热的方法处理.加热处理一般在真空中加热到500℃.保持一定时间.
b化学处理固体电极经过抛光处理后,接着应进行化学清洗.选择合适的有机溶剂及不同酸度的溶液进行清洗,可消除电极表面吸附性杂质及惰化层。
如在清除空气的盐酸溶液中,稍负于SCE电位下处理数秒钟,能清除玻碳电极表面的含氧基团.
c电化学处理这是最常用来清洁、活化电极的手段。
可直接在试液中进行,选择合适的溶液,可用恒电位、恒电流或循环伏安扫描法极化。
根据试验设定合适的处理条件(主要是电位扫描范围、试液组成、pH值等条件)。
选择合适的条件,可获得氧化的、还原的或中性的电极表面。
2.2电化学修饰电极的制备方法
化学修饰电极的制备是化学修饰电极得以开展研究的关键性步骤。
修饰方法的设计合理性与否、操作步骤及优劣程度对化学修饰电极的活性、稳定性和重现性有直接影响,因此是化学修饰电极研究和应用的基础.
目前已经发展的制备化学修饰电极的方法主要有滴涂法、共价键合法、电化学法、吸附法和掺杂法等。
目前人们研究得比较多的是滴涂法、共价键合法和电化学法这三种方法,而本文中电极的修饰方法就是滴涂法.
2.2。
1滴涂法
滴涂法是将溶解在适当溶剂中的聚合物或者纳米材料滴加或涂覆于电极表面,待溶剂蒸发干固后,生成涂膜结合在电极表面从而达到化学修饰的目的.具体方法为:
(A)将电极浸入修饰液中,取出后使附着于电极表面的溶液干固成膜;
(B)用微量注射器把一定已知量的修饰液注射到电极表面,然后于固成膜;
(C)电极在修饰液中旋转,使其溶液附着于电极表面,然后干固成膜该方法操作简单且直接。
但是,用滴涂法制备的修饰电极会因为溶剂的挥发而导致薄膜的厚度不均匀,并且重现性较差。
1.2。
2.2共价键合法
共价键合法是对电极表面进行预处理,以引入键合基,然后进行表面有机合成,通过化学键合反应将预定官能团修饰到电极表面.采用这种方法制备的修饰电极具有分子识别功能和选择性响应,并且稳定性很高。
1.2.2.3电化学法
电化学法包括以下三种:
电化学沉积法是一种将电极置于含有一定修饰材料的电解液中,采用恒电流或恒电位进行沉积而制备出修饰电极的方法。
电化学聚合法则是一种利用电化学氧化还原引发,使电活性的单体就地在电极表面发生聚合,生成聚合物膜而达到修饰目的的方法。
这类电活性单体大多含有乙烯基、羟基和氨基的芳香化合物以及杂环、稠环多核碳氢化合物和冠醚类化合物等。
这种方法主要被用来制备各种聚合物修饰电极。
电化学氧化法是利用电化学氧化作用使反应物在电极表面生成特定的产物,该产物最终通过吸附、组装或共价键合等作用修饰电极表面,从而制备化学修饰电极的一种方法.用该方法制备修饰电极的报道还不是很多。
2.3化学修饰电极在分析化学中的应用
从本质上看,化学修饰电极用于定量分析是一种把分离、富集和测定三者合而为一的理想体系。
董绍俊等总结了化学修饰电极用于定量分析时具有的功能:
①被测物能在修饰层中选择性地键合与富集;
②催化裸电极上具有缓慢电子转移速率的被测物的氧化还原;
③与生物分子特别是生物测定中的酶相结合;
④对电活性和表面活性干扰物具有选择性渗透与膜阻效应;
⑤非电活性离子被测物的电化学检测;
⑥电位响应。
基于这些功能,目前化学修饰电极在选择性富集分离、电催化、选择性渗透、传感器等方面以及流动注射、液相色谱检测器、非电活性离子的分析测定等方面有着广泛的应用。
3石墨烯简介
2004年,英国曼彻斯特大学(UniversityofManchester)AndreK。
Geim等[16]以石墨为原料,通过微机械力剥离法得到一系列叫作二维原子晶体(two-dimensionalatomiccrystals)的新材料——“石墨烯(graphene)”。
与碳纳米管相比,石墨烯有完美的杂化结构,大的共轭体系使其电子传输能力很强,电子穿过石墨烯几乎没有任何阻力,所产生的热量也非常少。
另外,石墨烯本身就是一个良好的导热体,可以很快地散发热量。
石墨烯跟钻石一样,都是纯碳,但它比钻石硬很多。
石墨烯是由碳原子构成的二维晶体,碳原子排列与石墨的单原子层一样,成蜂窝状(honeycomb)。
虽然它很结实,但是柔韧性跟塑料包装一样好,可以随意弯曲、折叠或者像卷轴一样卷起来。
石墨烯结构非常稳定,迄今为止,研究者仍未发现石墨烯中有碳原子缺失的情况。
石墨烯中各碳原子之间的连接非常柔韧,当施加外部机械力时,碳原子面就弯曲变形,从而使碳原子不必重新排列来适应外力,也就保持了结构稳定。
这种稳定的晶格结构使碳原子具有优秀的导电性。
石墨烯中的电子在轨道中移动时,不会因晶格缺陷或引入外来原子而发生散射。
由于原子间作用力十分强,在常温下,即使周围碳原子发生挤撞,石墨烯中电子受到的干扰也非常小。
石墨烯最大的特性是其中电子的运动速度达到了光速的1/300,远远超过了电子在一般导体中的运动速度。
“石墨烯”又名“单层石墨片”,是指一层密集的、包裹在蜂巢晶体点阵上的碳原子,碳原子排列成二维结构,与石墨的单原子层类似(图1-3)。
Geim等[17]利用纳米尺寸的金制“鹰架”,制造出悬挂于其上的单层石墨烯薄膜,发现悬挂的石墨烯薄膜并非“二维扁平结构”,而是具有“微波状的单层结构”,并将石墨烯单层结构的稳定性归结于其在“纳米尺度上的微观扭曲”。
图1-3石墨烯结构示意图
1.4石墨烯的结构和性质
4。
1石墨烯的结构
石墨烯(graphene)是碳原子紧密堆积成的单层二维蜂窝状(只包括六角原胞)晶格结构的一种碳质新材料,是构建其他维数碳质材料(如零维富勒烯、一维纳米碳管、三维石墨)的基本单元[18]。
完整的石墨烯具有理想的二维晶体结构,每个C原子通过很强的σ键与其它三个C原子相连接,强的C—C键使石墨烯片层有很强的结构刚性。
石墨烯中C原子都贡献的未成键的π电子,与平面成垂直的方向形成π轨道,且π电子可在晶体中自由移动,从而使得石墨烯有良好的导电性。
图1-4—1为石墨烯的结构示意图。
2石墨烯的性质
主要性质表现在以下几个方面:
1)载流子迁移和输运特性
石墨烯是零带隙半导体,具有独特的载流子特性。
它的电子与蜂窝状晶体结构周期势的相互作用产生了一种准粒子,即零质量的狄拉克-费米子(masslessDiracfermions),这种粒子具有类似于光子的特性。
室温下石墨烯具有10倍于商用硅片的高载流子迁移率(~10000cm2V—1s—1),表现出室温亚微米尺度的弹道传输特性(300K下可达0。
3µ
m)且受温度和掺杂效应的影响很小[16,19]。
2)量子霍尔效应
石墨烯特有的能带结构使空穴和电子相互分离,导致不规则量子霍尔效应的产生。
通过对石墨烯的电学性能研究人们发现了两种新型的量子霍耳效应.最近,Novoselov等观察到石墨烯具有室温量子霍耳效应,将原来的温度范围扩大了10倍[20]。
2009年,美国两个实验小组分别在graphene中观测到了填充数为1/3的分数量子霍尔效应[21,22]。
3)自旋性质
Tombros等人[23]研究了微米数量级下石墨烯中电子的自旋和拉莫尔旋进,清楚观察到了电子的两级自旋信号,且在4.2K、77K和室温下,自旋信号变化不大。
计算得知自旋驰豫长度在1.5微米和2.0微米之间,基本上不依赖于电流密度。
这个性质可使石墨烯在高频晶体管方面有其应用。
4)超导性质
作为sp2杂化材料,石墨烯具有独特的超导性质。
Heersche等[24]在石墨烯上连接两个电极,观察到有超电流通过,即使在零电荷密度时,也有超电流。
这说明石墨烯确实具有超导性.与碳纳米管和富勒烯相比,超导性能好,超导温度高.
另外,石墨烯的理论比表面积高达2600m2/g,具有突出的导热性能(3000W·
m—1·
K—1),优异的力学性能,杨氏模量(~1100GPa)和断裂强度(125GPa)[25]。
如前所述,石墨烯(graphene,GE)是碳纳米材料家族的新成员,具有二维层状纳米结构,室温下相当稳定[26].由于在GE中碳原子呈sp2杂化,贡献剩余一个p轨道上的电子形成了大π键,π电子可以自由移动,使GE具有优良的导电性。
石墨烯对一些酶呈现出优异的电子迁移能力;
并且对一些小分子(如H2O2,NADH),具有良好的催化性能,这使得石墨烯适合做基于酶的生物传感器,即葡萄糖传感器和乙醇生物传感器.在电化学中应用的石墨烯大部分都是由还原石墨烯氧化物得到的,也称为功能化石墨烯片或者化学还原石墨烯氧化物,这种物质通常有较多的结构缺陷和官能团,这在电化学应用上具有优势。
碳是电化学分析和电催化领域应用最广的材料。
例如,碳纳米管在生物传感器、生物燃料电池和质子交换膜(PEM)燃料电池方面有着良好的性能。
基于石墨烯的电极在电催化活性和宏观尺度的导电性上比碳纳米管更有优势。
因此,在电化学领域,石墨烯就有了大展身手的机会。
石墨烯在电化学传感器上的应用有以下优点[27,28]:
体积小,表面积大;
灵敏度高;
响应时间快;
电子传递快;
易于固定蛋白质并保持其活性;
减少表面污染的影响。
4.3石墨烯的电化学基础
有人通过氧化还原电对的循环伏安法研究了石墨烯的电子迁移行为[29],比如具有良好氧化还原峰的[Fe(CN)6]3-/4—和[Ru(NH3)6]3+/2+。
在循环伏安法中所有阴阳两极的峰值电流都和扫描速率的平方根呈线性关系,这表明石墨烯电极的氧化还原过程主要是由扩散控制的[30]。
在CV(循环伏安法)中,石墨烯中一个电子迁移的氧化还原电对的峰值电位差(ΔEp)是非常低的,很接近于59mV的理想值,比玻碳电极的要小很多[31];
另外,[Fe(CN)6]3-/4-为61.5—73mV(10mV/s),[Ru(NH3)6]3+/2+为60—65mV(100mV/s)。
峰值电位差和电子迁移系数相关,一个较低的峰值电位差表明石墨烯上的单电子电化学反应具有较快的电子迁移速率。
为了研究石墨烯对不同氧化还原系统的电化学响应,Tang等人[32]系统研究了三种有代表性的氧化还原电对:
[Ru(NH3)6]3+/2+,[Fe(CN)6]3—/4—和Fe3+/2+。
众所周知,[Ru(NH3)6]3+/2+几乎是对大多数电极表面缺陷和杂质不敏感的理想球面氧化还原系统,并且能够在对比几种碳电极材料的电子迁移率时作为基准;
[Fe(CN)6]3-/4—对表面敏感,但是对氧不敏感;
Fe3+/2+对表面和氧都敏感[31].从[Ru(NH3)6]3+/2+电对循环伏安法计算得来的石墨烯和玻碳电极的表观电子迁移常数分别是0。
18cm/s和0.055cm/s。
这表明,石墨烯的独特电子结构,尤其是在一个宽的能量范围的高的电子密度使得石墨烯具有较快的电子迁移速率[31]。
[Fe(CN)6]3-/4-电对计算得来的石墨烯和玻碳电极的表观电子迁移常数分别为0.49cm/s和0.029cm/s;
在石墨烯电极上的Fe3+/2+的电子迁移速率通常比玻碳电极上的电子迁移速率高几个数量级[30]。
这些研究结果都表明了石墨烯的电子结构和表面物化性质都是有利于电子迁移的[30—31]。
在本实验中,石墨烯极大的比表面积和优异光学、电学、热稳定性,为HRP固载提供了大的比表面积,提高了其催化活性,提高传感器的灵敏度和响应电流,提高了对H2O2检测的响应信号,缩短响应时间,提高检出限。
1.5壳聚糖简介
壳聚糖(Chitosan,CHIT)又称脱乙酰几丁质、聚氨基葡萄糖、可溶性甲壳素,是一种储量极为丰富的天然碱性高分子多糖,多为虾、蟹甲壳提取物,是由甲壳素脱去75%以上的N2乙酰基的产物,也是由氨基葡萄糖和N2乙酰基葡萄糖单元组成的共聚物。
它易溶于有机弱酸,形成均匀、透明的黏稠状溶液.其结构式为:
由结构式可知:
壳聚糖大分子链上分布大量羟基、氨基,同时骨架链间的氢键形成了壳聚糖大分子的二级结构,壳聚糖结构上的这一优点,使得它对许多离子、有机物、生物分子具有离子交换、螯合和吸附等特性,由于它具有优良的生物相容性、优异的成膜性和极强的吸附能力,因而近年来成为固定生物分子的优良材料[33-35]。
此在生物和医学领域得到了广泛的应用,越来越受到人们的重视。
因而被直接作为富集过程的吸附剂并在分析领域中得到广泛应用[36-37]。
在固定生物分子方面,尤其是酶的固定,构造安培型传感器引起了广泛的关注。
1.6课题来源及研究目的和意义
食品级双氧水在食品工业中可用于软包装纸的消毒、罐头厂的消毒剂、奶和奶制品杀菌、面包发酵、食品纤维的脱色等。
但是近期有媒体报道,部分不法商家在一些需要增白的食品,如各种海产干品、冻品、水发食品(牛百叶、海蛰、海米粉、鱼皮、水发鱿鱼等)、水果罐头、各种肉制品(白斩鸡、牛筋、牛肚、鸭、鹅掌、花肠、猪皮和猪蹄筋等)、面制品(饺子皮和馄饨皮)、及干果制品(果仁、果脯等)等的生产过程中,将其违禁浸泡工业用双氧水,以此来提高产品的外观.更有甚者将发霉的水产干品用双氧水来浸泡处理漂白,再重新出售;
或为消除病死鸡、鸭或猪肉表面的淤血和霉斑,将这些原料浸泡高浓度双氧水漂白加工,再添加人工色素出售。
值得注意的是,过氧化氢可通过与食品中的淀粉形成环氧化物,而环氧化物具有致癌性.但是,工业用双氧水的价格较食品级双氧水便宜,因此常在加工过程中违法使用.工业用双氧水中含有铅、砷、镍等重金属离子等多种有毒有害物质,这些有害物质就会残留到食物中,假如消费者食用了这些用工业双氧水加工处理的食品,可能致畸,甚至基因突变,更加严重危害食用者的健康。
因此,对双氧水含量的简便快速检测手段的开发迫在眉睫,双氧水的分析检测研究具有非常重要的实际意义。
第二章。
实验部分
2。
1试剂和仪器
CHI660C电化学工作站(上海辰华仪器公司)上进行,实验中采用三电极体系,其中工作电极为壳聚糖/石墨烯/辣根过氧化物酶修饰的复合金电极;
参比电极为饱和甘汞电极;
对电极为铂丝电极。
所有电化学实验都在环境温度下的4ml磷酸盐缓冲溶液(pH7。
0)中进行(室温),所有电位相对于饱和甘汞电极.CV实验在静止的电解质溶液中进行;
i-t实验在电磁搅拌的PBS溶液中进行.
CSB6L-180D型超声波清洗器(天津市考徳斯科技技有限公司),ALC-2103型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司),TTL-10B超纯水器(北京同赛联科技有限公司),其他试剂均为分析纯,实验用水均为超纯水。
2.2电极的制备
将金电极(直径2mm)在麂皮上用粒径为0.05μm〈-Al2O3粉末和水的混合物抛光,然后依次用无水乙醇、超纯水超声清洗10min,再用超纯水冲洗,晾干,可得到一个平滑光洁的新鲜电极表面.将已处理好的金电极置于混合液(0。
005mol。
L-1K3[Fe(CN)6]+0.1mol。
L-1KCl)中作循环伏安扫描,扫描范围是-0.2~0。
6V.若阴阳极峰对称,峰电流近似相等(Ipc/Ipa≈1),两者的电位差一般保持在110mv内,呈现出一对可逆性很好的氧化还原峰,即为达到实验所需要求。
电极不用时,4℃冰箱保存.
取100μg/L的辣根过氧化物酶(HRP)20μL,0.05%的壳聚糖5μL,2mg/L刚超声过的石墨烯溶液20μL于一次性离心试管中混合均匀.用20ul微量注射器吸取5µ
l制膜液涂在预处理过的金电极表面并于4︒C条件下过夜干燥。
所得电极表示为CHIT/HRP/Gr/Au.,最后,将酶电极用pH为6。
9的0.067molL—1的磷酸
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