江苏专用202x版高考生物新导学大一轮复习 第十一单元 生物技术实践 第39讲 无菌操作技术实践Word格式.docx
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②主要步骤:
准备接种→接种环灭菌→试管口灭菌→挑取少许菌种→划线接种→在37℃恒温箱中培养大肠杆菌24h→将增殖的菌种放置在冰箱的冷藏室中(4℃)保存。
(3)平板划线分离和培养大肠杆菌
①平板制作的方法及注意事项
a.请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程:
丙→乙→甲→丁。
b.甲、乙、丙中的灭菌方法是灼烧灭菌。
c.丁中的操作需要等待平板冷却凝固后才能进行。
②平板划线法是指用带有微生物的接种环在平板培养基表面通过分区划线而纯化分离微生物的一种方法。
易混辨析
消毒和灭菌
项目
条件
结果
常用方法
应用范围
消
毒
较为温和的物理或化学方法
仅杀死物体表面或内部的部分对人体有害的微生物
煮沸消毒法
日常用品
巴氏消毒法
不耐高温的液体
化学药剂消毒法
用酒精擦拭双手,用氯气消毒水源
灭
菌
强烈的理化因素
杀死物体内外所有的微生物,包括芽孢和孢子
灼烧灭菌法
接种工具
干热灭菌法
玻璃器皿、
金属用具等
高压蒸汽
灭菌法
培养基及容
器的灭菌
(1)培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐,有时还需要加入一些特殊的物质( √ )
(2)倒平板时,应将打开的皿盖放到一边,以免培养基溅到皿盖上( ×
)
(3)消毒的原则是既杀死材料表面的微生物,又减少消毒剂对细胞的伤害( √ )
(4)为了防止污染,接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落( ×
(5)用涂布平板法纯化大肠杆菌时,只要稀释度足够高,就能在培养基表面形成单个菌落( √ )
如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图,请分析:
(1)获得图A效果和图B效果的接种方法分别是什么?
提示 获得效果A的接种方法为涂布平板法,获得效果B的接种方法为平板划线法。
(2)某同学在纯化土壤中的细菌时,发现培养基上的菌落连成了一片,最可能的原因是什么?
应当怎样操作才可避免此种现象?
提示 最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌;
采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌。
(3)接种操作为什么一定要在火焰附近进行?
提示 火焰附近存在着无菌区域。
命题点一 微生物的培养和无菌技术分析
1.(2018·
全国Ⅱ,37)在生产、生活和科研实践中,经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。
回答下列问题:
(1)在实验室中,玻璃和金属材质的实验器具________(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。
(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法,与煮沸消毒法相比,这两种方法的优点是______________________________________________________________________。
(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒,其原因是紫外线能________________。
在照射前,适量喷洒________,可强化消毒效果。
(4)水厂供应的自来水通常是经过________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。
(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时,若压力达到设定要求,而锅内并没有达到相应温度,最可能的原因是____________________________________。
答案
(1)可以
(2)在达到消毒目的的同时,营养物质损失较少 (3)破坏DNA结构 消毒液 (4)氯气(5)未将锅内冷空气排尽
解析
(1)干热灭菌是指将物品放入干热灭菌箱内,在160~170℃条件下加热1~2h。
耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等,可采用干热灭菌的方法。
(2)巴氏消毒法是在70~75℃条件下煮30min或在80℃条件下煮15min,可以杀死牛奶中的微生物,并且使牛奶的营养物质损失较少。
(3)接种室、接种箱或超净工作台在使用前,可以用紫外线照射30min,紫外线能破坏微生物的DNA结构,以杀死物体表面或空气中的微生物。
在照射前,适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液,可以强化消毒效果。
(4)自来水通常是用氯气进行消毒的。
(5)在使用高压蒸汽灭菌锅时,若压力达到设定要求,而锅内并没有达到相应温度,最可能的原因是锅内原有的冷空气没有排尽。
2.高温淀粉酶在大规模工业生产中有很大的实用性。
研究者从热泉中筛选出了能高效生产高温淀粉酶的嗜热菌,其筛选过程如下图所示。
请据图回答下列问题:
(1)Ⅰ号培养基从物理状态来看,属于固体培养基,配制时要加入________________作为凝固剂,从用途来看属于选择培养基,应以________________作为唯一碳源。
(2)配制固体培养基的基本步骤是( )
A.计算、称量、倒平板、溶化、灭菌
B.计算、称量、溶化、倒平板、灭菌
C.计算、称量、溶化、灭菌、倒平板
D.计算、称量、灭菌、溶化、倒平板
(3)溶化时,烧杯中加入琼脂后要不停地____________,防止琼脂糊底引起烧杯破裂。
对培养基灭菌的方法一般为____________________。
(4)过程①是________________,过程②所使用的接种方法是________________法。
(5)部分嗜热菌在Ⅰ号培养基上生长时可释放________分解培养基中的淀粉,在菌落周围形成透明圈,挑选相应的菌落,接种到Ⅱ号培养基进一步分离纯化后,再对菌种进行________________培养。
答案
(1)琼脂 淀粉
(2)C (3)搅拌 高压蒸汽灭菌(4)稀释 涂布平板 (5)淀粉酶 扩大
解析
(1)固体培养基中通常加入琼脂作为凝固剂。
本实验的目的是获得生产高温淀粉酶的嗜热菌,故其选择培养基中应以淀粉作为唯一碳源。
(2)配制固体培养基的基本步骤是计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。
(3)配制培养基加热溶化时,要注意加入琼脂后要不断搅拌,防止琼脂糊底。
对培养基的灭菌一般采用高压蒸汽灭菌法。
(4)仔细观察题图可知,过程①是菌液稀释,过程②是采用涂布平板法接种。
(5)能产生淀粉酶的部分细菌能分解利用淀粉,其菌落周围会出现透明圈,取这样的菌落再分离纯化可获得相应菌种,以后可以对菌种进行扩大培养用于生产。
科学探究
(1)培养基的配制原则
①目的要明确:
配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。
②营养要协调:
注意各种营养物质的浓度和比例。
③pH要适宜:
细菌为6.5~7.5,放线菌为7.5~8.5,真菌为5.0~6.0,培养不同微生物所需的pH不同。
(2)微生物对主要营养物质的需求特点
①自养型微生物所需的主要营养物质是无机盐,碳源可来自大气中的CO2,氮源可由含氮无机盐提供。
②异养型微生物所需的营养物质主要是有机物,即碳源必须由含碳有机物提供,氮源也主要是由有机物提供,部分异养型微生物也可以利用无机氮源。
命题点二 微生物的纯化方法及过程分析
3.(2018·
全国Ⅲ,37)回答下列与酵母菌有关的问题:
(1)分离培养酵母菌通常使用____________(填“牛肉膏蛋白胨”“MS”或“麦芽汁琼脂”)培养基,该培养基应采用________灭菌法灭菌。
若将酵母菌划线接种在平板上,培养一段时间后可观察到菌落,菌落的含义是_________________________________________________。
(2)酵母菌液体培养时,若通入氧气,可促进________________(填“菌体快速增殖”“乙醇产生”或“乳酸产生”);
若进行厌氧培养,可促进____________(填“菌体快速增殖”“乙醇产生”或“乳酸产生”)。
(3)制作面包时,为使面包松软通常要在面粉中添加一定量的酵母菌,酵母菌引起面包松软的原因是___________________________________________________________________。
答案
(1)麦芽汁琼脂 高压蒸汽 由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体
(2)菌体快速增殖 乙醇产生 (3)酵母菌分解葡萄糖会产生CO2,CO2使面包松软
解析
(1)牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用广泛的细菌培养基;
MS培养基是满足植物细胞的营养和生理需要的培养基;
麦芽汁琼脂培养基通常用于酵母菌(真菌)的培养、鉴定及菌种保存。
培养基的灭菌方法为高压蒸汽灭菌法。
菌落是指由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。
(2)酵母菌为兼性厌氧型微生物,在有氧条件下进行有氧呼吸为其自身的繁殖提供能量;
在无氧条件下,酵母菌进行无氧呼吸产生乙醇。
(3)面包松软是因为制作过程中加入的酵母菌可以分解葡萄糖产生大量的CO2,CO2遇热膨胀,使得制作的面包松软多孔。
4.牛奶是微生物培养的良好培养基,牛奶在饮用前都要经过巴氏消毒,以杀死有害微生物,为检测消毒前后牛奶中细菌含量变化情况,做如图1所示操作。
用无菌吸管从锥形瓶中吸取1mL生牛奶稀释液至盛有9mL无菌水的试管中,混合均匀,如此再重复2次。
请回答下列有关问题:
(1)巴氏消毒的方法是____________________________,使用这种方法对生鲜牛奶进行消毒的好处是__________________________________。
(2)取最终的牛奶稀释液0.1mL滴在培养基上进行涂布,应选择的涂布工具是图2中的__________________。
(3)图1中所示方法为稀释涂布平板法,理想情况下,培养一段时间后可在培养基表面形成菌落。
若用该方法培养设置了3个培养皿,菌落数分别为35个、33个、34个,则可以推测生牛奶中每毫升含细菌数为__________个,运用这种方法统计的结果往往较实际值______________(填“偏大”或“偏小”),原因是________________________________。
(4)消毒后的牛奶中绝大部分细菌被杀死,若继续用该方法检测消毒后的牛奶中细菌的数量,则在操作步骤上应做什么改动?
__________________。
(5)从生牛奶取样培养得到的菌落中混有各种杂菌,从中检测出大肠杆菌的方法是在培养基中加入__________,若菌落具有____________特征,则可以认定为大肠杆菌。
答案
(1)在70~75℃煮30min(或在80℃煮15min) 牛奶的营养成分不被破坏
(2)B (3)3.4×
10
6 偏小 个别菌落可能是由两个或多个细胞形成的 (4)减少稀释次数 (5)伊红美蓝 (金属光泽的紫)黑色
解析
(1)巴氏消毒的方法是在70~75℃煮30min或在80℃煮15min,可以杀死牛奶中的微生物,并且使牛奶的营养成分不被破坏。
(2)涂布使用的工具是涂布器,图2中B正确。
(3)菌落的平均数是34个,生牛奶中每毫升含细菌数=菌落平均数/涂布量×
稀释倍数=34个/0.1mL×
104=3.4×
106个/mL。
在统计菌落时,当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是单个菌落,所以运用这种方法统计的结果往往比实际值偏小。
(4)由于消毒后牛奶中绝大部分细菌被杀死,所以可减少稀释次数。
(5)大肠杆菌的代谢产物会使伊红美蓝鉴别培养基出现金属光泽的紫黑色。
考点二 分离特定的微生物并测定其数量
1.区分涂布平板法和混合平板法
(1)过程如图
(2)结果不同
①涂布平板法:
细菌菌落通常仅在平板表面生长。
②混合平板法:
细菌菌落出现在平板表面及内部。
(3)目的相同:
分离各种目的微生物。
2.选择培养分离
(1)方法:
针对某种微生物的特性,设计一个特定的环境,使之特别适合这种微生物的生长,而抑制其他微生物的生长。
(2)原理:
不同微生物有不同的营养需求或对某种化学物质有不同的敏感性。
(3)用途:
从众多微生物中分离出特定的微生物。
3.菌落
(1)概念:
单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度,形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。
(2)特征:
不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落一般都具有稳定的特征,如菌落的大小、形状、边缘特征、隆起程度、颜色等,这些可以作为对微生物进行分类、鉴定的重要依据。
4.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(1)分离原理:
土壤中的细菌之所以能分解尿素,是因为它们能合成脲酶,这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。
(2)统计菌落数目一般用涂布平板法。
①统计菌落数目时,培养基表面生长的1个菌落,来源于样品稀释液中1个活菌。
为了保证结果准确,一般选择菌落数在30~300的平板进行计数。
②从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是(平均菌落数÷
涂布的稀释液体积)×
稀释倍数。
③利用涂布平板法成功统计菌落数目的关键是恰当的稀释度。
(3)实验流程:
土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察→细菌的计数。
5.分解纤维素的微生物的分离
(1)土壤中能分解纤维素的微生物种类很多,有细菌、真菌等,它们能分泌纤维素酶,将纤维素分解成小分子糖类物质以满足自身生命活动的需要,同时也能改善土壤的结构,提高土壤的肥力。
(2)纤维素分解菌的筛选
①原理
纤维素分解菌
↓
→红色复合物
红色消失,出现透明圈
②筛选方法:
刚果红染色法,即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
③培养基:
以纤维素为唯一碳源的选择培养基。
④实验流程
土壤取样:
富含纤维素的环境
↓
选择培养:
用选择培养基培养,以增加纤维素分解菌的浓度
梯度稀释:
制备系列稀释液
涂布平板:
将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
挑选产生透明圈的菌落
6.显微镜直接计数法
(1)原理:
利用血球计数板,在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。
(2)缺点:
不能区分死菌还是活菌。
(3)1mL培养液中菌体的总数换算公式为:
①16×
25型的血球计数板:
1mL悬液中待测标本(菌体)数=
×
400×
104×
②25×
16型的血球计数板:
(1)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类( ×
(2)对细菌进行计数只能采用涂布平板法,而不能用平板划线法( ×
(3)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中,尿素是唯一的氮源( √ )
(4)分解尿素的细菌在分解尿素时,可以将尿素转化为氨,使得培养基的酸碱度降低( ×
(5)刚果红可以与纤维素形成透明复合物,所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌( ×
研究人员在刚果红培养基平板上,筛选到了几株有透明降解圈的菌落如图1所示,将筛选到的纤维素酶高产菌株J1和J4在不同的温度和pH条件下进行发酵,测得发酵液中酶活性的结果如图2,请分析:
(1)透明圈是如何形成的?
提示 刚果红可以与纤维素形成红色复合物,但并不与纤维素降解产物发生这种反应。
细菌分泌的纤维素酶能将培养基中的纤维素降解,形成透明圈。
(2)图中透明圈大小代表什么?
降解纤维素能力最强的菌株是哪种?
提示 透明圈大小与纤维素酶的量和活性有关,降解纤维素能力最强的是菌株①。
(3)结合图2推测哪种菌株更适合用于人工瘤胃发酵?
提示 J4菌株在较高温度和酸性环境下酶的活性更高,更适合用于人工瘤胃发酵。
1.选择培养基的制作思路
(1)在培养基全部营养成分具备的前提下,加入物质:
如培养基中加入高浓度食盐时可抑制多种细菌的生长,但不影响金黄色葡萄球菌的生长,从而可将该菌分离出来;
在培养基中加入青霉素时可抑制细菌、放线菌的生长,但不影响酵母菌和霉菌的生长,从而可将这两种菌分离出来。
(2)通过改变培养基的营养成分达到分离微生物的目的:
培养基中缺乏氮源时,可分离自生固氮微生物,非自生固氮微生物因缺乏氮源而无法生存;
培养基中缺乏有机碳源时,自养微生物可利用空气中的CO2制造有机物生存,而异养微生物则无法生存。
(3)利用培养基的特定化学成分分离特定微生物:
如当石油是唯一碳源时,可抑制不能利用石油的微生物生长,使能够利用石油的微生物生长,从而分离出能消除石油污染的微生物。
(4)通过某些特殊环境分离微生物:
如在高盐环境中可分离耐盐菌,其他菌在盐浓度较高时易失水而不能生存;
在高温环境中可分离得到耐高温的微生物,其他微生物在高温环境中因酶失活而无法生存。
2.两种纯化细菌方法的辨析
比较项目
平板划线法
涂布平板法
关键操作
接种环在固体平板培养基表面连续划线
①一系列的梯度稀释
②涂布平板法操作
注意事项
每次划线前后均需灼烧接种环
稀释度要足够高,为确保实验成功可以适当增加稀释度的范围
菌体获取
在具有显著菌落特征的区域的菌落中挑取菌体
从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
优点
可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落
既可以获得单细胞菌落,又能对微生物进行计数
缺点
不能对微生物计数
操作复杂,需要涂布多个平板
命题点一 选择培养基成分及配制方法的分析
全国Ⅰ,37)将马铃薯去皮切块,加水煮沸一定时间,过滤得到马铃薯浸出液。
在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂,用水定容后灭菌,得到M培养基。
(1)M培养基若用于真菌的筛选,则培养基中应加入链霉素以抑制________的生长,加入了链霉素的培养基属于________培养基。
(2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质,营养物质类型除氮源外还有______________________(答出两点即可)。
氮源进入细胞后,可参与合成的生物大分子有_______________________(答出两点即可)。
(3)若在M培养基中用淀粉取代蔗糖,接种土壤滤液并培养,平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物。
加入的显色剂是________,该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是___________________________________________________________________。
(4)甲、乙两位同学用涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量,在同一稀释倍数下得到以下结果:
甲同学涂布了3个平板,统计的菌落数分别是110、140和149,取平均值133;
乙同学涂布了3个平板,统计的菌落数分别是27、169和176,取平均值124。
有人认为这两位同学的结果中,乙同学的结果可信度低,其原因是________________________
__________________________________________________________。
答案
(1)细菌 选择
(2)碳源、无机盐 蛋白质、核酸
(3)稀碘液 淀粉遇稀碘液显蓝色,产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解,形成透明圈 (4)乙同学的结果中,1个平板的计数结果与另2个相差悬殊,结果的重复性差
解析
(1)链霉素是抗生素,可抑制细菌生长,故在M培养基中加入链霉素作为选择培养基,可筛选出真菌。
(2)培养基中的营养成分一般包括碳源、氮源、水和无机盐等。
细胞中含有氮元素的生物大分子有蛋白质、核酸等,故所加入的氮源可参与以上物质的合成。
(3)淀粉遇碘变蓝,向加有淀粉的培养基中加入稀碘液后培养基呈现蓝色,产淀粉酶的菌落周围的淀粉被水解,形成透明圈,可根据透明圈的大小判断产生淀粉酶的多少。
(4)统计菌落数时一般选择菌落数在30~300个的平板,甲同学统计的3个平板中的菌落数在正常范围内且差距不大,比较准确;
乙同学统计的3个平板中,1个平板的计数结果与另2个相差悬殊,结果的重复性差。
2.苯酚是工业生产排放的有毒污染物质,自然界中存在着降解苯酚的微生物。
某工厂产生的废水中含有苯酚,为了降解废水中的苯酚,研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株,筛选的主要步骤如图所示,①为土壤样品。
(1)②中培养目的菌株的选择培养基中应加入________作为碳源,②中不同浓度碳源的培养基______________(填“影响”或“不影响”)细菌的数量,如果要测定②中活细菌数量,常采用______________________法。
(2)④为对照,微生物在④中不生长,在⑤中生长,④与⑤培养基的主要区别在于____________
______________________________________________________________________。
采用固体平板培养细菌时进行倒置培养的原因是_____________________________________
(3)实验过程中如何防止其他微生物的污染?
________________________________________________________________________。
答案
(1)苯酚 影响 涂布平板菌落计数
(2)④的培养基中没有加入苯酚作为碳源,⑤的培养基中加入了苯酚作为碳源 防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基 (3)培养基灭菌,接种环境灭菌,接种过程进行无菌操作
解析
(1)选择只能降解利用苯酚的细菌的培养基是以苯酚为唯一碳源的培养基;
苯酚是唯一的碳源,当苯酚消耗尽时,菌株因缺少碳源而不能继续繁殖,所以②中不同浓度的碳源会影响细菌数量;
一般采用涂布平板菌落计数法来测定②中活菌数目。
(2)④与⑤培养基的主要区别在于④的培养基中没有加入苯酚作为碳源,⑤的培养基中加入了苯酚作为碳源;
采用固体平板培养细菌时要倒置培养,以防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基。
(3)从制备培养基到接种与培养等全部实验过程要进行无菌操作。
无菌操作泛指在培养微生物的操作中,所有防
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