化妆品中克雷伯氏菌的检测方法检验检疫标准管理信息系统.docx
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化妆品中克雷伯氏菌的检测方法检验检疫标准管理信息系统
出口果蔬汁中环状脂肪酸芽孢杆菌检测方法
计划编号:
2009B136
编制说明
项目承担单位:
中国检验检疫科学研究院
项目负责人:
赵贵明
项目起止时间:
2010.1-2010.10
二〇一〇年十月
《出口果蔬汁中环状脂肪酸芽孢杆菌检测方法》
编制说明
一、工作情况和任务来源
1.任务来源
本部分为国家质量监督检验检疫部门下达的2010年度制标任务计划,计划编号为2009B136。
2.标准制订的工作过程
①标准的申报;②资料查询整理;③制定工作计划;④标准方法的验证;⑤按照GB/T1.1-2000进行标准和编制说明的起草并送专家征求意见;⑥总结反馈信息和意见对标准进行改进;⑦整理资料申报有关部门审定。
3.完成单位:
中国检验检疫科学研究院、珠海出入境检验检疫局、陕西出入境检验检疫局、吉林省产品质量监督检验院、北京奥博星生物技术有限公司。
4.标准起草人:
本标准第1部分主要起草人:
赵贵明张琦王小玉赵勇胜史艳宇杨海荣胡玥冯家望葛秋惠。
本标准第2部分主要起草人:
史艳宇赵贵明邴炜王娉华蕾
二、编制本标准的目的和意义
近几年,我国果蔬汁出口贸易稳步上升,2006-2007榨季,中国浓缩苹果汁出口量就达到104万吨,占到国际市场贸易总量的67%,成为我国食品工业中发展最快的行业之一,预计到2010年用于果汁加工的水果总量将达到2482万吨,而腐败微生物是既农残之后成为影响果蔬汁产品质量及国际贸易的主要因素。
在果蔬汁生产过程中,从原料到产品要经过选果-清洗-压榨-酶解-超滤-脱色-浓缩(杀菌)环节,由于原料、环境、空气中存在环脂芽孢杆菌及其芽孢,不可避免将芽孢带入成品中,即使在酸性条件下经过巴氏杀菌仍不能将其灭活,产品放置一段时间后,芽孢萌发,在代谢过程中产生愈创木酚和2,6-二溴苯酚,有类似“草药味”或“防腐剂”的不爽味道,1×10-12的含量就能造成果汁风味败坏并产生轻微沉淀。
为此,从1999年,美国等进口国要求浓缩果汁中嗜酸耐热菌小于1个/10ml(g);2001年欧洲大部分果汁消费国也提出相同指标要求,而到2002年后,对50ml浓缩果汁中嗜酸耐热菌不得检出几乎成为常规指标,目前阳性样品的比例约为2%,其比例已高于其他食品中的病原微生物。
导致果蔬汁腐败的微生物,细胞膜含有共同的ω-环状脂肪酸,1992年Wisotzkey等人根据16SrDNA基因序列分析结果,将它们从芽孢杆菌属(Bacillus)中划分出来,成立一新属,命名为环状脂肪酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus),简称为环脂芽孢杆菌,该属菌目前包括8个种、2个亚种。
由于目前企业缺乏快速、有效的检测和监控手段,使得产品流通到消费者手中腐败才会被发现,成为浓缩果汁生产厂家最为棘手的问题。
目前已有果汁中检测环脂酸芽孢杆菌的方法,如日本果汁协会耐酸耐热菌统一检测方法、美国库克实验室耐热耐酸菌的检测方法、日本NDM公司耐热耐酸菌的检测方法、美国雀巢公司耐热耐酸菌检测方法等,但国内外没有标准方法,不同实验室采用不同检测方法,常使检测结果存在差异,直接影响了我国果蔬汁的出口贸易。
因此,制订检验标准,将大力推进产业发展,保障我国果蔬汁出口贸易顺利进行。
三、标准的主要内容依据
本标准共分为二个部分,第1部分“分离与计数方法”的内容参照国际果汁生产商联合会(InternationalFederationofFruitJuiceProducters,IFU)颁布的“导致果汁变质的果汁中环状脂肪酸芽孢杆菌检测方法”(MethodontheDetectionofTaintProducingAlicyclobacillusinFruitJuice)2007版进行实践研究,并通过试验和验证后制订。
第2部分“荧光PCR方法”为快速筛选方法,参考文献“Developmentofareal-timePCR-basedsystemtargetingthe16SrRNAgenesequenceforrapiddetectionofAlicyclobacillusspp.injuiceproducts”(InternationalJournalofFoodMicrobiology99(2005)229–235),并通过试验和验证后制订。
第1部分分离与计数方法
本部分采用的样品处理方法、增菌方法、分离培养基及可疑菌落鉴定方法研究如下:
1材料
1.1培养基及试剂
1.1.1K琼脂
成分:
酵母提取物2.5g
蛋白胨5.0g
葡萄糖1.0g
吐温801.0g
琼脂15.0g
制法:
将上述成分混合,加入1L去离子水。
121℃高压灭菌15min。
冷却至50℃,用25%苹果酸调节pH值至3.7。
1.1.2YSG琼脂及YSG肉汤
成分:
酵母提取物2.0g
葡萄糖1.0g
可溶性淀粉2.0g
琼脂15.0g
制法:
将上述成分混合,加入1L去离子水。
121℃高压灭菌15min。
冷却至50℃,用1N盐酸调节pH值至3.7。
YSG肉汤:
成分同YSG琼脂培养基,但不包括琼脂。
调节pH值后再121℃高压灭菌15min。
1.1.3BAT琼脂及BAT肉汤
成分:
CaCl2.2H2O0.25g
MgSO4.7H2O0.50g
(NH4)2SO40.20g
KH2PO43.0g
酵母提取物2.0g
葡萄糖5.0g
痕量矿物质溶液1.0mL
去离子水500mL
用1NH2SO4或者1NNaOH调节pH值至4.0。
121℃高压灭菌15min后冷却至50℃。
痕量矿物质溶液:
A)CaCl2.2H2O0.66g
ZnSO4.7H2O0.18g
CuSO4.5H2O0.16g
MnSO4.H2O0.15g
COCl2.6H2O0.18g
H3BO30.10g
NaMoO4.2H2O0.30g
去离子水1000mL
高压灭菌后于冰箱中保存。
B)琼脂15g~20g
去离子水500mL
121℃高压灭菌15min后冷却至50℃。
无菌等体积混合A.4.1和A.4.2,必要时调节pH值至4.0,倒平板。
BAT肉汤:
成分同BAT琼脂培养基,但不包括琼脂。
调节pH值后再121℃高压灭菌15min。
1.1.4香草酸:
100mg/kg。
1.2试验菌株
环状脂肪酸芽孢杆菌:
1)AlicyclobacillusacidocaldariusATCC43030,
2)AlicyclobacillusacidocaldariusATCC43031,
3)AlicyclobacillusacidocaldariusATCC43033,
4)AlicyclobacillusacidoterrestrisATCC49025,
5)AlicyclobacillusacidoterrestrisATCC49027,
6)AlicyclobacilluscycloheptanicusATCC49029,
7)Alicyclobacillusacidocaldariussubsp.AcidocaldariusATCC27009,
8)AlicyclobacillussendaiensisATCCBAA-609,
9)Alicyclobacillussp.ATCCBAA-757,
10)AlicyclobacillusvulcanalisATCCBAA-915,均购自美国典型培养物保藏中心。
菌种按照ATCC提供的培养基和培养条件复苏后分别接种ATCC要求的培养基培养后备用。
其他参考菌株:
枯草芽孢杆菌IQCC22734;蜡样芽孢杆菌IQCC22735,地衣芽孢杆菌IQCC22736,来自中国中国检科院食品安全研究所菌种保藏中心。
1.3实验样品
样品基质为浓缩苹果汁,样品来源于陕西出入境检验检疫局微生物实验室保存样品。
本实验所用实验样品,6份。
原始标号分别为经采用本标准制定的出口果蔬汁中环状脂肪酸芽孢杆菌检测方法检测,结果均为阴性。
表1果汁样品编号
实验编号
原始编号
原产地
1
070104-5245
山西
2
070113-7137
山西
3
070121-5263
山西
4
061017-10395
陕西
5
2807075-61101
陕西
6
2807077-61103
陕西
2.方法与结果
2.1增菌培养
环状脂肪酸芽孢杆菌43030、43031、43033、49025、49027、49029、27009、BAA-609、BAA-757、BAA-915以及枯草芽孢杆菌;蜡样芽孢杆菌,地衣芽孢杆菌的菌液1ml,分别接种于10mlBAT肉汤和YSG肉汤,置培养箱45℃±1℃培养2d,观察试验菌株其在不同肉汤中的生长情况(见表2),经观察环状脂肪酸芽孢杆菌在BAT肉汤和YSG肉汤中生长差异不大,但其他芽孢杆菌不生长。
表2.实验菌株在不同肉汤中的生长情况
培养液
菌种号
BAT增菌液
YSG增菌液
43030
+++
+++
43031
+++
+++
43033
+++
+++
49025
++++
++++
49027
++++
++++
49029
+++
+++
27009
+++
+++
BAA-609
+++
+++
BAA-757
+++
+++
BAA-915
+++
+++
22734
-
-
22735
-
-
22736
-
-
2.2.分离培养
环状脂肪酸芽孢杆菌43030、43031、43033、49025、49027、49029、27009、BAA-609、BAA-757、BAA-915以及枯草芽孢杆菌;蜡样芽孢杆菌,地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌7316的菌液,各取一环,四区法划线接种于BAT、YSG和K琼脂平板,45℃±1℃培养48h-32h,观察实验菌株在上述平板上的生长情况,见表3。
表3实验菌株在不同平板上的生长情况及菌落形态
平板
菌株
K琼脂
YSG琼脂
BAT琼脂
生长
形态
生长
形态
生长
形态
43030
-
++
菌落扁平,边缘不规则,无色
+++
菌落扁平,边缘不规则,无色
43031
-
++
菌落扁平,边缘不规则,无色
+++
菌落扁平,边缘不规则,无色
43033
-
++
菌落扁平,边缘不规则,无色
+++
菌落扁平,边缘不规则,无色
49025
++++
菌落圆形,较大,白色,不透明
++++
菌落圆形,较大,黄白色,不透明
++++
菌落圆形,较大,黄白色,不透明
49027
++++
菌落圆形,较大,白色,不透明
++++
菌落圆形,较大,黄白色,不透明
++++
菌落圆形,较大,黄白色,不透明
49029
-
++
菌落圆形,较小,黄白色,不透明
+++
菌落圆形,较小,黄白色,不透明
27009
-
++
菌落圆形,较小,黄白色,不透明
+++
菌落圆形,较小,黄白色,不透明
BAA-609
-
++
菌落圆形,微黄色,湿润中心凸起
+++
菌落圆形,微黄色,湿润中心凸起
BAA-75
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