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1.2细菌纤维素的聚合度,结晶度及其性质
BC的聚合度随着培养方式和条件不同而有很大差异,动态培养时较低,约为3000-5000,静态培养时可以高达16000,优质棉纤维为113000-14000,棉短绒为5000左右,木浆纤维素为7000-10000。
结晶度高于普通高等植物纤维,而低于藻类(Vatinia)和动物纤维(Tunicin)。
结晶度增加,纤维的抗强度、氏模量、硬度、比重和体积的稳定性会随之增加,而伸长率、吸湿性、润胀度、柔软性和化学反应性均会随之降低。
但是BC纤维的吸湿性、润胀度、柔软性和化学反应活性却比高等植物纤维素好得多这个反常规的原因可能是由于细菌纤维超细(纳米级)特点所造成,有待于深入研究。
Strobin等通过凝胶渗透色谱法研究了BC在不同培养时间以及培养基组成时的聚合度和聚合度分布性,结果表明:
随培养时间的延长,其聚合度随之增加,到28天时开始降低,但聚合度分布性却增加。
1.3细菌纤维素膜的结构与性质
BC成膜性能好,BC膜的抗撕能力比聚乙烯膜和聚氯乙烯膜要强5倍;
BC膜持水量高,其部有很多“孔道”,有良好的透气、透水性能,通常情况下持水率大于1:
50,经特殊处理可达1:
700,并且具有高的湿强度。
Wfochowicz等采用X-射线衍射研究了在不同培养时间发酵的细菌纤维素的纳米结构;
采用重量分析法可知膜的持水率随培养时间延长而从193%降到120%。
广角衍射测试表明:
不管培养时间的长短,膜均有半结晶形态;
小角衍射测试表明纤维素结晶纤维随机地分布在无定相中。
Dubey研究了除去蛋白质后的BC膜在二元溶剂体系(水-醇)中的全蒸发,随乙醇的浓度增加,对纤维素膜的渗透通量、选择性、全蒸发分离指数(PSI)和吸气度进行了研究,发现纤维素膜对水有高的选择性,当乙醇浓度高于70%时纤维素膜仍能透过95%的水,当二元体系中含水量少于30%时,纤维素膜对水的选择度在125-287围,渗透通量高于100g/m2,PSIy约为104g/m2h。
1.4细菌纤维素的介电性能
Baranov等研究了由纳米晶体构成的BC在频率100Hz到1MHz之间,温度在100-400K之间的介电性能,高温状态下纤维素的介电常数的异常行为可以通过纤维素中水分子的吸附和解吸特征来解释,低于320K时,纤维素膜吸水,而高于此温度时将解吸水。
1.5细菌纤维素的溶解性能
Tamai发现BC在8%的二甲基乙酞胺的溶液中溶解形成均质溶液,而在某个浓度时会形成非均质溶液。
B.Laszkiewicz从实验中发现,BC像云杉纤维一样,聚合度低于400,可以在-5℃下溶于8.5%的NaOH溶液中。
当NaOH溶液中加入1%的尿素时,BC的溶解度会增加,聚合度不超过560就可以溶解。
这个实验结果具有重要的实用意义,它指出了不用汽蒸或酶生物转移活化纤维素,而是通过纤维素纺丝液制备纤维的可能性。
这种方法不同于传统的粘胶法生产纤维素,溶剂是一种对环境无毒,价格便宜,不需要制备纤维素衍生物的直接溶剂。
1.6其他性质
较高的生物适应性和良好的生物可降解性,可利用广泛的基质进行生产可以进行烷基化、轻烷基化、羧甲基化、硝基化、氰乙基化、氨基甲酸酯化以及多种接枝共聚反应和交联反应,其化学反应的可及度和反应性均强于普通植物纤维。
日本学者在用BC、棉短绒和木浆纤维制造三醋酸纤维素酯和二醋酸纤维素酯时发现,相同条件下,BC完成反应速度快、耗时少。
2.细菌纤维素的生物合成
目前除醋酸菌属外,根瘤菌属(Rhizobium)、八叠球菌属(Sarcina)、假单胞菌属(Pseudomonas)、无色杆菌属(Achromobacter)、产碱菌属(Alcaligenes)、气杆菌属(Aerobacter)、固氮菌属(Azotobacter)等的某些种也能生成细菌纤维素。
研究比较全面的是木醋杆菌(Acetobacterxylinum)。
在木醋杆菌生物代过程中戊糖循环(HMP)和柠檬酸循环(TCA)2条代途径参与了细菌纤维素的生物合成。
由于糖酵解(EMP)活力缺乏或微弱,即缺乏磷酸果糖激酶或酶活力微弱,因此木醋杆菌不能在厌氧条件下代葡萄糖。
从草酰乙酸经丙酮酸盐,由于草酰乙酸脱羧酶和丙酮酸盐激酶奇特调节作用,木醋杆菌发生糖原异生作用。
在这种条件下,一条代途径是由己糖磷酸盐通过异构化和磷酸化,直接合成纤维素。
另一种为非直接途径,即经过戊糖循环和葡糖异生途径生成纤维素。
其中由己糖磷酸盐直接转化成纤维素时,不需要己糖碳骨架中碳链的改变。
由己糖磷酸盐或通过五碳糖循环生成纤维素都需能量代系统进行调节,其调节位点在对ATP敏感、连接葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)上。
在木醋杆菌中有两种不同的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,但只有一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶被ATP抑制。
木醋杆菌生物合成纤维素与氧化代过程同步进行,但与蛋白质合成体系无关。
细菌纤维素合成的前体物为尿苷二磷酸葡萄糖,由葡萄糖合成纤维素的4个主要酶催反应步骤分别是:
葡萄糖激酶的对葡萄糖的磷酸化作用;
葡萄糖磷酸异构酶将6-磷酸葡萄糖通过异构作用转化成1-磷酸葡萄糖;
焦磷酸化酶将1-磷酸葡萄糖转化成尿苷二磷酸葡萄糖;
以及纤维素合成酶的合成作用。
纤维素合成酶催化合成纤维素的最后一步为:
UDP-Glc+(β-1,4-glucose)n→UDP+(β-1,4-glucose)n+1
通过对木醋杆菌细菌纤维素生物合成的研究,发现细菌纤维素合成步骤的最后一步是在细胞膜上进行的。
c-di-GMP(环状鸟苷酸)是细菌纤维素合成调节机制的关键因子,c-di-GMP是作为纤维素合成酶变构催化剂起作用。
在纤维素生物合成中如果没有c-di-GMP,纤维素合成酶将失去活性。
c-di-GMP浓度的高或低(合成或降解)被认为是由两条具有相反作用途径并由与这两条途径有关的与膜相连的二鸟苷酸环化酶控制。
两个GTP(鸟苷三磷酸)分子在二鸟苷酸环化酶催化作用下,首先释放出一个分子PPi后转变为线性二核苷酸三磷酸pppGpG,在释放出一分子PPi,进而合成c-di-GMP,与此同时,PPi迅速的分解而生成Pi。
Mg2+对二鸟苷酸环化酶有激活作用。
纤维素的生物合成将由于两种c-di-GMP磷酸二酯酶A和B的作用而终止。
PDE-A从环形结构上切下单个的磷酸二酯,将具有活性的c-di-GMP变为不具活性的线性二聚物pGpG。
非活性的二聚物磷酸二酯酶B(PDE-B)的催化作用下被转变为2个5′-GMP。
Ca2+选择性抑制PDE-A的活性。
细菌纤维素的分泌过程是伴随细菌纤维素的生物合成同时进行的。
随着醋酸菌生长,大约12至70分子的细菌纤维素从细胞表面间隔大约为10nm的微孔同时分泌到培养基中。
在细胞表面这些纤维素分子通过氢键互相连接,形成纯的纤维素纤丝。
这种纤丝在纯度上和超分子结构上优于植物纤维素的纤丝。
细菌纤维素的X-射线的分析显示了纤维素颗粒(分子)的具有高度规则的晶体结构。
细菌纤维素纤丝的网眼结构有很大的表面积,具有高持水能力和抗撕强度。
一个醋酸杆菌可以在培养基过β-1,4糖苷键聚合20000个葡糖分子形成单一、扭曲、带状的微细纤维。
带状的微细纤维随着细胞的生长分裂而并不断裂。
事实上,纤维素的生成模型中,葡糖聚合以及微细纤维素的连接作用是紧密相连同时进行的两个步骤。
3细菌纤维素的发酵生产
木醋杆菌的培养方法有静态法和动态法。
静态法是指将菌种静置培养,在发酵液表面产生纤维素膜。
动态法则是在机械搅拌罐或气升式生化反应器风培养细菌,纤维素完全分散在发酵液中,呈不规则的丝状、星状或微团状。
木醋杆菌发酵生产纤维素需要适合发酵条件的培养基,且培养基的组成对纤维素的产量有很大的影响。
另外,改进发酵工艺设计合理的发酵装置、优良菌株的获得,都是获得理想的纤维素产品的途径。
向基础培养基中添加适量的烟酸胺、乙醇、木素磺化盐、琼脂、聚多糖、醋酸和柠檬酸等可以提高BC的产量。
S.Keshk等研究了培养基中加入木素磺化盐对BC产量和结构性质的影响。
Tonouchi等人发现在木醋杆菌生产纤维素的过程中加入少量的纤维素酶可以提高纤维素的产量。
设计不同类型的反应器,如:
硅橡胶膜生物反应器、板或圆盘生物反应器、旋转盘生物反应器、改进的气升式生物反应器等来提高纤维素产量。
4细菌纤维素的改性
4.1生物改性
BC是由醋酸菌属、土壤杆菌属、根瘤菌属和八叠球菌属中的某种微生物在不同的条件下发酵合成的。
不同的培养方式、不同的培养基组成以及不同的培养模型,都会对发酵产物的结构与性能产生很大的影响。
采用不同的培养方法,如静态培养和动态培养,利用醋酸菌可以得到不同高级结构的纤维素。
通过调节培养条件,也可得到化学性质有差异的BC。
例如在培养液中加入水溶性高分子如羧甲基纤维素、半纤维素、壳聚糖、荧光染料以及葡聚糖切酶等可获得不同微结构和聚集行为的纤维,而羧甲基纤维素或羧甲基甲壳素的导入使BC具有了吸收和交换金属离子的特性。
此外,改变不同葡萄糖衍生物碳源可控制微纤维的纳米尺寸,运用不同的模型可形成各种形状的功能材料。
4.2化学改性
生物改性虽然是一种绿色可持续的方法,但是存在微生物发酵环境要求严格、培养周期长、成本高等问题。
相比于生物改性,化学改性合成衍生物目标明确,不受试剂种类的限制且反应时间短,也是一种很有开发潜力的BC改性途径。
目前国对植物纤维素的改性研究已经有了很深入的研究,而BC与植物纤维素一样可以进行羧甲基化、乙酰化、磷酸化、磺酸化以及多种接枝共聚反应和交联反应,以制备一系列纤维素衍生物。
BC有着比植物纤维素更优良的性能,独特的纳米纤维结构使其比表面积更大。
在化学反应过程中,BC分子链上的-OH具有更高的活性和可及度,因而相对于植物纤维素BC反应速度快、反应时间短。
但是BC高的结晶度和强的分子之间作用力使得其溶解性能很差,不溶于酸碱以及常用的有机溶剂,均相反应较难实现,因而目前主要是通过表面改性和非均相改性的方法对BC进行改性。
4.3复合改性
复合改性相对于前两种改性方法来说,操作更加简单环保,能在一定程度上改善BC的力学、光学、细胞粘附等性能,也是一种比较实用的方法。
Cai等将BC水凝胶膜直接浸入胶原(COL)溶液中一定时间后经冷冻-解冻制得COL-BC复合水凝胶。
胶原的引入明显提高了BC对3T3成纤维细胞黏附性,同时胶原对BC也起到了一定的增强作用。
COL-BC复合支架材料具有较好的生物活性,有利于细胞的黏附增殖,同时还具有较高的力学强度,是一种具有广阔应用前景的生物医用材料。
Wang等将BC膜在一定浓度的PVA溶液中浸泡一定时间后经冷冻-解冻法,溶胀平衡,真空干燥制得BC-PVA复合膜材料
5细菌纤维素在生物医学材料中应用
细菌纤维素由于具有独特的生物亲和性、生物相容性、生物可降解性、生物适应性和无过敏反应,以及高的持水性和结晶度、良好的纳米纤维网络、高的力和强度,尤其是良好的机械韧性,因此在组织工程支架、人工血管、人工皮肤以及治疗皮肤损伤等方面具有广泛的用途,是国际生物医用材料研究的热点之一。
5.1BC在组织工程支架中的应用
生物相容性对于组织工程支架的构建是必不可少的。
在研究组织工程BC支架构建中,体生物相容性的评价非常重要。
Helenius等系统地研究了BC的体生物相容性。
实验中他们把BC植入老鼠体1~12周,利用组织免疫化学和电子显微镜技术,从慢性炎症反应、异物排斥反应以及细胞向生长和血管生成等方面的特征来评价植入物的体相容性。
结果发现植入物周围无肉眼和显微镜可见的炎症反应,没有纤维化被膜和巨细胞生成。
BC被成纤维细胞侵入,与宿主组织融为一体,未引起任何慢性炎症反应。
因此可以断定BC的生物相容性非常好,在组织工程支架构建方面具有潜在价值。
5.2BC在人工血管中的应用
众所周知,当血管由于动脉硬化、血管老化或破损等原因不能正常工作时,需进行血管移植重建。
全世界每年要施行的许多血管重建手术由于自体血管来源有限,而异体血管强烈的排异作用,以及来源少和价格昂贵等原因,常不得不使用人工合成血管作为替代品。
目前,国际临床上使用最广泛的、用于替代大于6mm的人工血管是编织型的涤纶聚酯血管和膨体聚四氟乙烯血管,这是因为它们结构稳定性好,在体可长期工作而不发生降解,但是它们仍存在着不少缺点和不足,譬如血栓的形成和新生膜增厚导致血管堵塞,至今尚无十分理想的血管替代物。
基于同样原因,用于置换小于6mm的动、静脉血管的人工血管还没有开发成功。
临床上是采用自体血管进行修复,例如冠状动脉搭桥手术。
近30年来,人们一直在致力于这方面的研究。
5.3BC在人工皮肤以及皮肤损伤治疗中的应用
自1987年以来有近10个皮肤伤病医疗单位已报道400多例应用BC膜治疗烧伤、烫伤、褥疮、皮肤移植、创伤和慢性皮肤溃疡等取得成功的实例,现已有用其制成的人工皮肤、纱布、绷带和创口贴等伤科敷料商品。
与其它人工皮肤和伤科敷料相比,该膜的主要特点是在潮湿情况下机械强度高、对液、气及电解物有良好的通透性、与皮肤相容性好,
无刺激性,可有效缓解疼痛,防止细菌的感染和吸收伤口渗出的液体,促进伤口的快速愈合,有利于皮肤组织生长。
此膜还可作为缓释药物的载体携带各种药物,利于皮肤表面给药,促使创面的愈合和康复。
6结束语
生物医学材料由于直接关系到人类的生命与健康,且面临着全球人口的巨大市场需求,因而得到世界各国的广泛重视。
目前对细菌纤维素的研究主要集中在附加值较高的医学生物材料上,例如组织工程支架、骨支架、软骨支架、人工血管、人工皮肤以及药物载体等方面。
但是真正能应用到临床上的产品还不多,除了巴西的商品BioFill外,大部分的研究还停留在细胞水平和动物实验等初级阶段,离临床应用仍有一定距离。
在我国,人们对细菌纤维素的了解和认识还不足,对其研究尚处于初级阶段,大部分集中在食品、食品添加剂和造纸应用等方面,在生物医用材料上的开发应用上相关报道较少。
由于细菌纤维素具有优秀的生物亲和性、生物相容性、生物适应性和良好的生物可降解性,因此该纤维素必将成为世界上性能优异的新型生物纳米高技术材料。
目前BC应用的主要技术障碍一是发酵水平较低,产量低、成本高、价格不抵普通植物纤维素,二是进一步研究和利用BC的成模和成型的工艺技术还没有解决,三是做为生物医用材料,其与生物体长期作用效果、体的降解性、与宿主组织和细胞相容性,以及在体时BC的机械、物理和化学性能的变化等一系列问题还需要进一步研究。
要解决上述问题,今后的研究方向主要有两个:
一是要研究设计可行的发酵设备及发酵工艺以提高纤维素产量,降低其成本;
二是要研制开发具有自主知识产权的BC生物医用材料。
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