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但是,由于结核菌在属间和种间存有共同的抗原决定簇,加之其与体液免疫的相关性目前尚未得到充分的阐明,因而在综合提高实验的敏感性和特异性方面未能取得实质性的进展[11-13]。
结核病免疫学检测,目前最常用的是PPD试验,以机体对注射的PPD是否产生变态反应来判断机体曾否感染过结核菌而作为一项辅助诊断指标。
但是,由于PPD中含有许多分支杆菌共同的抗原,如卡介苗接种者PPD试验可呈现阳性结果,PPD皮试阳性并不能鉴别是因为结核分枝杆菌复合群感染还是接触环境中非结核分枝杆菌或卡介苗接种后造成的致敏。
PPD皮试诊断的特异性差,用该方法进行结核病流行病学调查获得的结核分支杆菌感染率并不能真正反映人群中结核分支杆菌感染的实际状况。
重症肺结核病人则往往因为机体免疫力低下而呈现阴性结果等情形,都大大降低了其临床价值[14]。
另外,近年来发展起来的分子诊断技术如PCR、PCR-RFLP、real-timePCR以及基因芯片技术,大多数需要数小时才可以得到结果,且这些技术需要昂贵的仪器,存在假阳性和假阴性的问题,对实验室硬件和检测人员素质要求较高,故非常不适用于现场的快速检验、早期排查和诊断[4,15,16]。
时间分辨荧光分析法(timeresolvedfluoroimmunoassay,TRFIA)是近十年发展起来的一种微量分析方法,是目前最灵敏的微量分析技术,灵敏度完全可与放射免疫分析技术相媲美,甚至超过放射免疫分析的水平。
时间分辨荧光分析法实际上是在荧光免疫分析(fluorescentimmunoassay,FIA)的基础上发展起来的一种特殊的荧光分析。
在通常的荧光分析中,由于测试样品中含有多种荧光成分,背景荧光(来自胶体颗粒和溶剂分子引起的散射光、血清蛋白质和其他化合物发出的非特异性荧光)强度大,干扰强,成为荧光分析法大范围推广使用的瓶颈。
时间分辨荧光免疫分析法可以有效的解决这一难题。
它的基本原理用镧系金属离子(如Eu3+、Sm3+、Tb3+、Dy3+)作为示踪物标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞,镧系元素作为示踪剂有以下特点:
①荧光物质激发光谱曲线的最大吸收波长和发射光谱的最大发射波长之间的差,称为Stokes位移。
普通荧光物质荧光光谱的Stokes位移只有几十纳米,激发光谱和发射光谱通常有部分重叠,互相干扰严重。
镧系元素Stokes位移达200nm,很容易分辨激发光和发射光,从而排除激发光干扰;
②镧系元素与普通的荧光团比较,镧系元素离子螯合物荧光的衰变时间长,为传统荧光的103~106倍,镧系元素的荧光半衰期介于10~1000μs之间。
这样,用时间分辨荧光仪测量镧系元素的荧光时,在脉冲光源激发之后,可以适当的延迟一段时间,待血清、容器、样品管和其他成分的短半衰期荧光衰变后再测量,这时就只存镧系元素标记物的特异性荧光。
通过时间延迟和波长分辨,极大地降低了本底荧光。
待反应(如抗原抗体免疫反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等)发生反应后,用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度,即可推测反应体系中分析物的浓度,达到定量分析的目的。
TRFIA具有以下优点:
①灵敏度高,检测下限为1pmol,达到或超过放射免疫分析水平;
②线性范围宽,可达6个数量级,远远宽于ELISA的线性范围,也超过化学的线性范围;
③不受样品中自然荧光干扰,背景低;
④可多重标记(如两种不同的抗原可分别用Eu3+、Sm3+标记),一个试剂盒能够同时检测出两种或两种以上的项目;
⑤操作简便、易自动化,标记物制备简便且稳定,无放射性污染。
由于TRFIA技术集酶标记、同位素标记技术的优点于一身,同时又克服了它们的局限。
因此,TRFIA是一种公认的继RIA、EIA之后最有发展前途、值得推广的非放射免疫标记技术,目前已经成为基础医学研究和临床治疗监测等方面的重要手段[17-19]。
近年来,人们对结核分枝杆菌培养的滤液进行了深入的研究,分离出了多种分泌蛋白,如MPT64、PT70、MPT63、MPT53、Ag85、CPF10和ESAT6[20]。
其中,结核杆菌培养滤液蛋白10(culturefiltrateprotein10,CFP10)和早期分泌性抗原靶6(earlysecretoryantigenictarget-6,ESAT6)为结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌所特有,卡介苗(BCG)及非致病分枝杆菌缺乏。
CFP10与ESAT6同属于ESAT6家族,且由同一操纵子调控,产生的蛋白能诱导机体产生强烈的免疫应答[21-24]。
ESAT6分子量很小,仅6KD,难于用双抗夹心法进行检测。
本研究采用时间分辨荧光免疫分析双抗夹心技术,建立了定量检测CFP10的方法,初步临床试验结果表明,CFP10用于结核患者血清检测敏感性较低,但用于结核性胸腔积液的诊断敏感性在80%以上,特异性达100%,是一个非常有开发潜力的结核病新型诊断试剂盒,可以有效地鉴别诊断结核性、癌性和其他感染性胸腔积液。
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(三)项目主要研究开发内容、技术关键及主要创新点。
开发内容:
①结核杆菌CFP10的原核表达。
②以纯化的CFP10作为抗原,通过杂交瘤细胞技术得到CFP10的单克隆抗体。
③建立基于时间分辨荧光免疫分析的结核病新型诊断技术:
采用双抗夹心法检测CFP10。
④临床应用及评价。
技术关键:
建立时间分辨荧光免疫分析检测CFP10的新方法:
采用双抗夹心法。
经筛选得到最佳配对的两株单克隆抗体,一株单克隆抗体包被固相载体,另一株单克隆抗体用Eu3+标记,经过免疫反应形成免疫复合物后,用增强液将Eu3+从复合物上完全解离下来,与另一种螯合剂结合,检测荧光信号。
荧光信号强弱与CFP10含量成正比。
由于时间分辨荧光免疫技术检测线性范围宽,因此我们可以精确地对CFP10进行定量分析。
主要创新点:
目前结核病的诊断主要采用分离培养、微生物学、免疫学和分子生物学方法,存在的主要问题是检测时间长,或者容易出现假阳性、假阴性问题,或者需要昂贵的仪器和试剂。
CFP10为结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌特有,卡介苗及非致病分枝杆菌缺乏这两种蛋白,因此检测CFP10可以避免因非致病分枝杆菌感染或接种卡介苗而出现假阳性问题。
国内外已建立ELISA等方法来检测CFP10,但ELISA灵敏度较低,容易出现假阴性,线性范围也很窄,难于定量分析。
我们建立基于时间分辨荧光免疫技术检测CFP10的方法,可以大大提高检测的灵敏度,同时还可较对精确地进行定量分析。
目前国内外还没有这方面的文献报道。
由于时间分辨荧光免疫技术可以精确地对CFP10进行定量检测,我们就可以探讨CFP10含量与结核病临床分期(结核菌潜伏感染期、结核病非活动期、活动不排菌期、耐药结核病和肺外结核病之间)的关系,为结核病的早期诊断、病程监测及其治疗提供技术支持。
单抗的活性、特异性和匹配性对免疫试剂盒至关重要。
由于CFP10分子量不大,10KD,如果以CFP10完整肽链免疫小鼠制备抗体,由于抗体针对的抗原决定簇不明,抗体两两配对往往是盲目的,只要两株抗体存在结合的抗原表位存在几个氨基酸的重复,则配对肯定不成功。
本研究采用CFP10多肽(肽段)制备单克隆抗体制备:
根据抗原性、亲水性、表露性、柔韧性等原则设计针对CFP10不同部位的多肽片段,将这些片段与载体蛋白——血蓝蛋白(KLH)偶联,免疫小鼠,用基因工程表达的CFP10重组蛋白筛选杂交瘤细胞,以避免产生血蓝蛋白抗体克隆的干扰。
这样就可以得到一系列针对CFP10明确抗原决定簇的单克隆抗体,然后将这些抗体两两配对进行筛选,以得到检测CFP10的最佳配对抗体。
这样操作制备的多肽抗体比用CFP10整个多肽链免疫小鼠制备单克隆抗体更容易配对成功且效果更佳。
(四)项目预期目标(主要技术经济指标、社会效益、技术应用和产业化前景以及获取自主知识产权的情况)。
(1)建立-时间分辨荧光免疫分析检测CFP10的新方法,该方法具有高灵敏度、高特异性、定量精确的特点,主要技术指标达到国际先进水平或国内领先水平。
利用建立的方法为临床诊断和治疗结核病提供技术上的支持,开发成产品应用于临床,市场前景广阔,完全可以创造出良好的社会效益和经济效益。
(2)开发具有自主知识产权的结核病诊断试剂盒,为申报医疗器械三类体外诊断试剂注册证书创造条件,申报国家发明专利1项,撰写科研论文1-2篇。
(3)建立时间分辨荧光免疫分析技术平台,为研制其它疾病标志物的诊断试剂盒提供技术支撑。
(五)项目实施方案、技术路线、组织方式与课题分解。
(1)研究方案
①重组抗原的原核表达:
以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板,分别设计针对CFP10的特异性引物,进行PCR扩增,PCR产物纯化后与表达质粒pET32a(+)构建成重组质粒pET-cfp10。
在大肠杆菌BL21(DE3)中表达带组氨酸标签的蛋白,经亲和层析得到纯化CFP10蛋白。
②单克隆抗体制备:
选用6~10周龄、健康、发育良好的雄性BALB/c小鼠,人工合成的CFP10多肽与血蓝蛋白偶联后作为抗原,与等量完全福氏佐剂(CFA)充分乳化后对小鼠腹腔或皮下多点注射,以后每间隔2周以同样剂量抗原加等量不完全福氏佐剂腹腔或皮下注射,共3~5次。
末次免疫后3~4天,分离脾细胞与骨髓瘤细胞株Sp2/0用PEG进行融合。
用HAT培养基进行筛选,融合细胞呈克隆生长,细胞培养至覆盖20%孔底时,吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。
首先依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔,将孔中细胞再行克隆化,尔后进行抗原特异的ELISA测定,选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存于液氮。
单克隆抗体的制备采用小鼠腹腔接种法。
选用BALB/c小鼠,先用液体石蜡行小鼠腹腔注射,一周后将5×
105杂交瘤细胞/鼠接种到腹腔中。
接种一周后收集腹水。
单克隆抗体纯化采用亲和层析法,用抗小鼠球蛋白抗体与载体(Sepharose)交联,制备亲和层析柱,将抗体结合后洗脱,回收后得到CFP10的单克隆抗体。
③建立基于时间分辨荧光免疫分析的结核病新型诊断技术。
结核杆菌培养滤液蛋白10(CFP10):
双抗点夹心分析法。
针对CFP10上不同抗原决定簇的两个单克隆抗体,一个包被固相载体,另一个用Eu3+标记,经过免疫反应形成免疫复合物后,用增强液将Eu3+从复合物上完全解离下来,与另一种螯合剂结合,检测荧光信号。
④临床应用及评价:
将我们建立的时间分辨荧光免疫技术检测CFP10的方法应用于临床,并与国产和进口的检测结核杆菌的试剂进行对比,评价CFP10时间分辨荧光免疫法的临床应用价值。
(2)技术路线:
(3)组织方式与课题分解:
该项目系本校课题组先建立基于时间分辨荧光免疫分析检测CFP10的方法,并从结核病医院收集临床标本进行验证,进而与生物技术公司合作开发成产品加以推广应用。
(六)计划进度安排。
2012.01-2012.12:
临床应用与评价。
大量收集结核患者的胸腔积液(或关节积液、脑脊液等)样本,将建立的方法应用于临床,并与结核分枝杆菌的其他检测结果进行对比,评价该方法的临床应用价值。
2013.01-2013.12:
分析数据,撰写科研论文1-3篇,申报国家发明专利1项,为申报医疗器械三类体外诊断试剂盒注册证创造条件。
(七)现有工作基础和条件。
(1)本项目已开展的前期研究工作
一、CFP10的表达
M12
M:
DNAmarker(2000、1000、750、500、250、100bp);
1:
PCR扩增产物;
2:
以pET24b-CFP10为模板的PCR扩增产物
图1CFP10PCR扩增产物
M1
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