微生物生理学实验指导版文档格式.docx
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此过程通过羧化、转移、缩合三步来完成:
第一步,羧化:
乙酰CoA在乙酰辅酶A羧化酶(ACC)作用下转化为丙二酸单酰辅酶A(Mal-CoA)。
ACC有4个独立的蛋白构成(AccA,AccB,AccC,AccD),其中AccB的行使功能需要生物素作为共价结合的辅因子(Cronanetal,2002)。
第二步,转移:
Mal-CoA在丙二酰转酰基酶(FabD)的作用下将丙二酸单酰基团转移至ACP上,形成Mal–ACP(Jackowskietal,1987)。
第三步,缩合:
在β酮脂酰ACP合成酶III(KASIII,FabH)的作用下将乙酰CoA所携带的酰基链合缩合到Mal-ACP上,生成β酮丁酰ACP,起始新的酰基链的生成(Revilletal,2001)。
图1大肠杆菌脂肪酸合成途径
2.酰基链的延长:
FASII中有四种关键酶行使碳链延长的功能,该延长过程是以循环的形式进行,每次循环都经过缩合、还原、脱水、再还原四个步骤,使脂肪酸碳链延长两个碳原子(Whiteetal,2005;
Zhangetal,2008a)。
第一步,缩合:
碳链的延长是由β酮脂酰ACP合成酶(-ketoactyl-ACPsynthetase,KAS)来催化完成的。
延伸反应中β酮脂酰ACP合成酶有KASI(FabB)和KASII(FabF)两种。
每次缩合反应,碳链延长两个C原子,同时在酰基链的β位引入一个酮基(Bergleretal,1992;
D'
Agnoloetal,1975)。
第二步,还原:
KAS在延长碳链的同时引入了β位酮基,该基团在β酮酯酰ACP还原酶(-ketoactyl-ACPreductase,KAR,FabG)的作用下加氢还原,转化为羟基集团,将β酮酯酰ACP转化成为β羟酯酰ACP,同时将还原剂NADPH氧化(Priceetal,2001;
2004)。
第三步,脱水:
β羟酯酰ACP脱水形成反2稀酯酰ACP为一可逆反应。
该过程由不同底物专一性的两种β羟酯酰ACP脱水酶(-hydroxydecanoyl-ACPdehydratase,HAD):
FabZ和FabA催化完成(Irametal,2005;
Mohanetal,1994)。
第四步,再还原:
循环反应的最后一步由烯酯酰ACP还原酶(FabI)(enoyl-ACPreductase,ENR)来催化完成,将反2烯酯酰ACP还原为饱和酯酰ACP,同时消耗辅因子NADH(Heathetal,1995;
Heathetal,2002b;
Massengo-Tiasseetal,2008)。
各种细菌间FAS的成分不同,最终的脂肪酸酰基链的长度也有所不同。
一般延伸到16-18个碳原子的链长的脂酰ACP时,碳链停止延长,作为磷脂合成的前体物质被利用(Zhangetal,2008a;
b)。
铜绿色假单胞菌(pseudomonasaeruginosa),医学上称绿脓杆菌,是假单胞菌属(pseudomonas)中极为重要的一个种。
该菌是革蓝氏阴性细菌,杆状,广泛分布于自然界及正常人皮肤、肠道和呼吸道,是临床上较常见的条件致病菌之一。
本实验的目的就是搞清楚铜绿假单胞菌是否有fabI同源基因,若有PafabI的功能怎样?
是否与大肠杆菌的FabI的功能相同抑或有一些相异的功能。
因此我们将本次微生物生理实验的课程名定为铜绿假单胞菌fabI基因的克隆及功能鉴定。
2000年,铜绿假单胞菌PAO1菌株全基因组测序完成,并由61位科学家组成的科研小组完成了其基因组的注释工作。
PAO1菌株基因组全长6,264,403bp包含有5565个基因或者假想基因。
铜绿假单胞菌基因组测序及注释工作的完成,为研究铜绿假单胞菌脂肪酸合成路径提供了方便。
我们可以根据同源序列法克隆目标基因。
目前,世界上主要的基因库有:
(1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,其网上地址为http:
//www.ebi.ac.uk/ebi-home.html;
(2)Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库,其网上地址http:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/web/
search/index.html;
(3)Swissport和TREMBL,Swissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确度比较高,而TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。
目前,以Genbank的应用最频繁。
这些基因库是相互联系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。
从上述数据库中查询所要研究的目标蛋白或基因,然后从中获得基因的全长序列。
根据整个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基因。
实验一细菌总DNA的提取与检测
一、实验器材
铜绿假单胞菌PAO1;
WTL缓冲液;
PCP缓冲液;
异丙醇;
70%的乙醇;
RNaseA;
1.5ml离心管;
各种枪头;
移液器;
水浴锅;
高速台式离心机;
旋转蒸发仪;
琼脂糖凝胶电泳系统;
紫外分光光度计。
二、目的要求
(1)了解常用的细菌总DNA制备方法的原理和适用范围。
(2)学习细菌总DNA的操作技术。
三、基本原理
细菌基因组的大小一般为1-5Mb。
制备纯的质量高的总DNA是进行细菌基因组分析、基因克隆和遗传转化研究等的基础。
细菌总DNA的制备方法很多,但大都包括两个主要步骤:
先裂解细胞,接着采用化学或酶学方法除去样品中的蛋白质、RNA、多糖等大分子,本实验采用Omega公司的SQTissueDNAKit方法简化了提总DNA的步骤,样品首先用WTL缓冲液裂解细胞,用PCP缓冲液使蛋白质沉淀下来,而总DNA存留在上清液中,然后用异丙醇沉淀得到高质量的细菌总DNA。
四、操作步骤
(1)细菌总DNA的提取(按Omega的BacterialDNAKit方法)
1.用1.5ml离心管收集1.0ml过夜培养的铜绿假单胞菌PAO1菌液10,000rpm室温离心1min,每个组收集两管进行后面的操作;
2.去上清液,加入180μlTE溶液,充分悬浮细胞后,加入20uLIS溶液,室温保存10min;
3.5,000rpm离心5min,去上清,加入200uLBTL溶液充分悬浮细胞;
(可选择步骤:
对于G+细菌,加入30uLGP溶液,剧烈震荡5min;
将上清转移至另一个离心管。
)
将样品于55°
C水浴60min使细胞裂解完全。
4.加入25μL蛋白酶K,充分混匀,将样品置于55°
C水浴60min,没10min颠倒混匀一次,使细胞裂解完全。
5.加入5μLRNaseA颠倒数次混匀,室温静置20min,(可选择步骤:
10,000rpm离心5min,转移上清至另一个干净离心管)
6.加入220uLBDL溶液,充分混匀,65°
C水浴10min,加入220uL无水乙醇,充分混匀,如果有沉淀,吹打去除沉淀。
7.将上清转移至吸附柱中,10,000rpm离心离心1min,去承接液;
8.加入500μLHB溶液,10000rpm离心离心1min,去承接液;
9.加入500μLWB溶液,10000rpm离心离心1min,去承接液;
10.重复步骤9一次
11.12000rpm离心2min
12.将吸附柱转移至一个新的1.5mL离心管中,加入100μLEB溶液,静置3min
13.10000rpm离心1min,收集洗脱液。
(2)琼脂糖凝胶电泳检测总DNA
1.清洗并安装好的制胶槽,插入适当的梳子。
2.称取0.5g琼脂糖于三角瓶中,加入50ml0.5×
TBE电泳缓冲液,称量三角瓶总重量。
摇匀后放在微波炉上加热并且不断摇动,至琼脂糖完全溶解,加水补足原重。
待冷却到约50°
C后(不烫手为宜),加4μlGoldView,摇匀后倒入摆好的18孔制胶板中冷却凝固,1h以后使用。
3.凝固后垂直向上拔出梳子。
连同制胶板一同取出凝胶,清理制胶板下侧和制胶槽内的碎胶,放入已装有0.5×
TBE电泳缓冲液的电泳槽中,以浸过胶面5mm为宜。
4.用移液器吸取适量DNA样品,1μl10xloadingbuffer在点样板上混匀后点样,记好各组的点样孔位置。
5.情况需要时,可在另一点样孔中加入3-5μl标准分子量DNAMarker;
6.调节电压至100V-120V,直至蓝色溴芬蓝条带到达凝胶2/3-3/4处可断电;
7.将凝胶置于紫外透射检测仪上,于305nm观察样品的亮度和带形并拍照记录。
附:
TBE电泳母液(10×
)的配制
1)分别称取54克Tris碱,27.5克硼酸,20ml0.5mol/EDTA(PH=8.0)
2)将各组分别加入1升烧杯中,用ddH2O定容到1升.
3)在电泳时使用1倍工作液,按1:
4与水混合.
4)1倍液是为了增加电泳工作液的电流的电流量.
铜绿假单胞菌PAO1DNA模版;
目的基因fabI的特异引物对;
10×
PCRBuffer;
5mMdNTPmix:
含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各5mM;
Taq酶;
0.2ml离心管;
PCR扩增仪;
(1)了解引物设计的方法和要求,了解AT克隆的原理。
(2)学习PCR扩增的操作技术。
聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,为最常用的分子生物学技术之一。
典型的PCR由
(1)高温变性模板;
(2)引物与模板退火;
(3)引物沿模板延伸三步反应组成一个循环,通过多次循环反应,使目的DNA得以迅速扩增。
其主要步骤是:
将待扩增的模板DNA置高温下(通常为93°
C-94°
C)使其变性解成单链;
人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合,两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短;
耐热的DNA聚合酶(Taq酶)在72°
C将单核苷酸从引物的3'
端开始掺入,以目的基因为模板从5'
→3'
方向延伸,合成DNA的新互补链。
PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段,并能轻易在皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。
因此,PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。
它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析,还可以用于突变体和重组体的构建,基因表达调控的研究,基因多态性的分析,遗传病和传染病的诊断,肿瘤机制的探索,法医鉴定等多方面。
引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则:
(1)引物长度约为16-30bp,太短会降低退火温度影响引物与模板配对,从而使非特异性增高。
太长则比较浪费,且难以合成。
(2)引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度Tm=4(G+C)+2(A+T)。
(3)四种碱基应随机分布,在3'
端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。
(4)引物3'
端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应,以减少由于密码子摆动产生的不配对。
(5)在引物内,尤其在3'
端应不存在二级结构。
(6)两引物之间尤其在3'
端不能互补,以防出现引物二聚体,减少产量。
两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。
(7)引物5'
端对扩增特异性影响不大,可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。
通常应在5'
端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。
(8)引物不与模板结合位点以外的序列互补。
所扩增产物本身无稳定的二级结构,以免产生非特异性扩增,影响产量。
(9)简并引物应选用简并程度低的密码子,例如选用只有一种密码子的Met,3'
端应不存在简并性。
PCR产物的AT克隆系统由Invitrogen公司(SanDiego,CA)发展而来的商业性试剂盒,它用于PCR产物的克隆和测序。
其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3'
末端加上一个非模板依赖的A,而T载体是一种带有3'
T突出端的载体,在连接酶作用下,可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点(MCS)中。
(1)PCR反应
1.在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.2ml离心管中。
表2.4.1PCR反应体系
成分
用量
PCRbuffer
3μL
dNTPmix(10mM)
1μL
上下游引物混合(5μM)
Taq酶(1U/μL)
DNA模板(20ng-100ng)
ddH2O
To30μL
注:
1.如果DNA模板中G+C含量过高,可以在反应体系中添加5%的甘油和5%的DMSO;
2.DNA模板浓度不需要严格定量,根据不同需要,模板使用量有所不同,菌落PCR中可以直接挑取少量菌体作为DNA模板。
2.调整好反应程序。
将上述混合液稍加离心,立即置PCR仪上进行扩增,PCR程序如下表所示。
表2.5.2PCR反应基本程序
步骤
温度
时间
预变性
94°
C
3min
变性
30sec
退火
58°
延伸
72°
1min
循环
35
times
充分延伸:
10min
结束
——
End
退火温度一般为引物Tm值-3°
C,Taq酶延伸时间为1min/kb,pfu酶延伸时间为2min/kb
3.结束反应,PCR产物放置于4°
C待电泳检测或-20°
C长期保存。
(2)PCR产物的电泳检测
如在反应管中加有石蜡油,需用100μl氯仿进行抽提反应混合液,以除去石蜡油;
否则,直接取5μlPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。
(3)PCR产物的纯化/回收(由于时间关系此实验没有安排)
PCR产物经电泳后,若有合适大小的DNA片段的特异扩增,则需要对一些DNA电泳片段进行回收和纯化,用于亚克隆、探针标记等。
DNA回收和纯化常用方法有压碎法、低融点琼脂糖法、冻融法等,也有现成的试剂盒供应。
(4)PCR产物的AT克隆(由于时间关系此实验没有安排)
AT克隆的原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3'
1.连接反应一般在灭菌的0.2ml离心管中进行。
2.10μl体积反应体系如下:
①取T载体1μl(50ng),加入等摩尔数PCR产物。
②加入含ATP的10×
Buffer1μl,T4DNA连接酶,用ddH2O补足至10μl。
3.稍加离心,通常为14-16°
C水浴连接8-14hr,或4°
C过夜。
4.转化后进行蓝白斑筛选获得阳性克隆
实验三铜绿假单胞菌pafabI基因表达载体构建
一、质粒载体构建方案
本实验中主要用到pMD19-T、pBAD24M、pET28(b)三种克隆和表达用质粒载体。
首先PCR扩增基因并将目的基因克隆到pMD19-T载体上,然后通过DNA限制性内切酶酶切和粘性末端连接将基因转移到所需要的表达载体上,从而构建了三个系列的质粒,如下图所示。
图3.1质粒载体构建方案
二、构建质粒载体
采用PCR反应,从铜绿假单胞菌PAO1菌株的基因组中扩增出pafabI基因,连接pMD19-T载体,得到pafabI-T个质粒。
通过NdeI和HindIII两种限制性DNA内切酶,将pMD19-T载体携带的pafabI基因克隆到pBAD24M及pET28(b)载体上。
pBAD24M载体具有pBAD启动子,所携带的基因受阿拉伯糖诱导调控;
pET28(b)载体上具有T7启动子,该载体转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株后,所携带的基因能在IPTG诱导的T7DNA聚合酶作用下高效表达。
另外,pET28(b)载体表达6×
His-Tag融合蛋白,可用于Ni-NTA琼脂糖介导的亲和层析纯化。
实验四质粒的提取与检测
1、材料
pBAD24m-FabI(5.3kb)和pET28-FabI(6.8kb)单菌落平板;
1.5ml塑料离心管(又称eppendorf管);
离心管架;
枪头。
2、试剂
LB液体培养基、固体培养基(灭菌)、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Km)
3mol/lNaAc(pH5.2):
50ml水中溶解40.81gNaAc·
3H2O,用冰醋酸调pH至5.2,加水定容至100ml,分装后高压灭菌,储存于4°
C冰箱。
溶液Ⅰ:
50mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris.Cl(pH8.0),10mmol/LEDTA(pH8.0)。
溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4°
溶液Ⅱ:
0.2mol/LNaOH(临用前用10mol/LNaOH母液稀释),1%SDS。
溶液Ⅲ:
5mol/LKAc60ml,冰醋酸11.5ml,H2O28.5ml,定容至100ml,并高压灭菌。
溶液终浓度为:
K+3mol/L,Acˉ5mol/L。
HB缓冲液:
DNAwashbuffer:
TE:
10mMTris-HCl(pH8.0),1mMEDTA(pH8.0)。
1MTris-HCl(pH8.0)1ml,0.5MEDTA(pH8.0)0.2ml,加ddH2O至100ml。
15lbf/in2高压湿热灭菌20min,4°
C保存备用。
脂糖凝胶电泳试剂:
5×
TAEbuffer:
(实验室提供)
0.5×
500ml/班
1%琼脂糖胶:
20ml/班
Goldview
10×
loadingbuffer
3、器具
微量取液器(20μl,200μl,1000μl);
台式高速离心机;
恒温振荡摇床;
高压蒸汽消毒器(灭菌锅);
涡旋振荡器;
电泳仪;
琼脂糖平板电泳装置;
离心管;
点样板;
废液缸;
酒精灯;
接种环。
(1)学习和掌握碱裂解法抽提质粒DNA的原理、方法和技术。
(2)为下次质粒的转化提供实验样品。
把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。
细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。
质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。
F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型:
紧密控制型(Stringentcontrol)和松驰控制型(Relaxedcontrol)。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如ColE1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。
利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。
当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种,这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。
但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。
质粒通常含有编码某些酶的基因,其表型包括对抗生素的抗性,产生某些抗生素,降解复杂有机物,产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。
质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。
与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点
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