分子生物学综合实验报告.docx
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分子生物学综合实验报告
分子生物学综合试验报告
综合实验Ⅰ.Southern杂交
(质粒DNA提取、PCR技术体外扩增DNA、质粒载体和外源DNA的连接反应、
地高辛标记的Southern杂交)
一.实验目的
1.学习Southern杂交的原理及操作方法。
2.学习碱裂解法提取质粒的原理。
3.学习PCR反应的基本原理和实验技术;了解引物设计的一般要求。
4.掌握DNA体外连接的基本技能,了解连接反应的注意事项。
二.实验原理
利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。
在碱变性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋解开而变性,质粒DNA氢键也大部分断裂,双螺旋也有部分解开,但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离,当pH=的乙酸钠将其pH调到中性时,变性的质粒DNA又恢复到原来的碱裂解法提取质粒的主要原理是:
利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而构型,而染色体DNA不能复性,形成缠绕的致密网状结构,离心后,由于浮力密度不同,染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
聚合酶链反应(PCR)是体外酶促合成DNA片段的一种技术,PCR进行的基本条件:
DNA模板(在RT-PCR中模板是RNA)、引物、dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)、TaqDNA聚合酶、反应缓冲体系。
PCR循环由三个步骤组成:
变性、退火、延伸。
每一个循环的产物可作为下一个循环的模板,通过30个左右循环后,目的片段的扩增可达106倍。
DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。
DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来。
最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。
对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。
一个片段是平末端,另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对,则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。
通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。
地高辛随机引物法标记的原理:
在随机引物法标记的反应液中,有随机合成的六聚核苷酸作为引物,dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物,以单链DNA作为模板,在Klenow酶的作用下,合成插入地高辛的DNA链。
以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后,再通过免疫反应进行检测。
一般通过酶标记地高辛抗体检测,就可以肯定杂交反应的存在。
免疫检验一般用碱性磷酸酶系统,BClP/NBT显色,敏感性很高。
三.实验准备
1.实验材料:
含质粒的大肠杆菌DH5α,LB液体培养基,LB平板培养基
2.实验试剂:
TaqDNA聚合酶,10×反应缓冲液(含25mmolMgCl2),dNTP,引物(P1、P2),溴乙啶(EB),点样缓冲液Loadingbuffer(10×):
%溴酚蓝,40%甘油,目的基因及载体,2×ligation缓冲液,T4DNA连接酶,LCaCl2,氨苄青霉素(100mg/mL),TBE电泳缓冲液(5×),DIGRandomLabelingMix(高效),Anti-DIG-APConjugate,BCIP/NBTStockSolution,BlockingReagent。
20×SSC:
柠檬酸钠,3MNaCl,2×SSC:
柠檬酸钠,NaCl,EDTA,变性液:
NaOH,NaCl,中和度:
Tris-HCl、、3MNaCl,Standardbuffer:
5×SSC、%(w/v)N-Lauroylsarcosine,%(w/v)SDS,1%BlockingReagent,Standardbuffer+50%formamide,Anti-DIG-AP碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗体,BCIP/NBT储备液,冲洗液:
0.1MTris-HCl,MNaCl.pH=,封闭液:
1%BlockingReagent/Tris-HCl,NaCl,显色缓冲液:
Tris-HCl,NaCl,pH=,TE缓冲液:
10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH,2%,LB固体培养基(添加amp的终浓度为100μg/ml,添加arabinose为培养基的%),溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,TE缓冲液,无水乙醇和70%乙醇。
3.实验仪器:
微量移液器,离心管,DNA吸附柱,DNA收集管,台式离心机,电泳仪,凝胶成像系统,恒温水浴箱,PCR仪,培养皿,超净工作台,硝酸纤维素膜或尼龙膜。
四.试验方法
1.质粒的提取:
①培养细菌
将带有质粒的大肠杆菌接种于LB平板培养基上,37℃培养24小时,然后从平板上挑取单菌落,接种于5ml液体培养基中,37℃培养12小时。
②提取步骤
●取mL过夜培养的菌液,加入离心管中,6000rpm离心1min,尽量吸除上清,重复两次
●向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA),使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
●向离心管中加入250μL溶液P2,温和翻转多次使菌体充分裂解。
●向离心管中加入350μL溶液P3,温和翻转多次,充分混匀,此时将出现白色絮状沉淀。
12,000rpm离心10min。
●将上一步收集的上清液转移到吸附柱CP3中,注意尽量不要吸出沉淀。
12,000rpm离心1Min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3放入收集管中。
●向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW,12,000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3放入收集管中。
●重复操作步骤6。
●将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm离心2min。
●将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位滴加50μL洗脱缓冲液EB,室温放置2min,12,000rpm离心1min将质粒溶液收集到离心管中。
③琼脂糖凝胶电泳法检测提取的质粒DNA
2.聚合酶链式反应(PCR)技术体外扩增DNA:
●按下表加入试剂,并小心混匀。
模板为实验一中提取的质粒DNA
试剂
体积(30µl)
ddH2O
12µl
PrimerP1(µM)
1µl
PrimerP2(µM)
1µl
模板
1µl
2xTaqMix
15µl
●设置PCR程序
●运行PCR程序
●反应结束后,取20μlPCR产物进行%琼脂糖电泳分析
3.地高辛标记的Southern杂交:
●将转移好的尼龙膜或硝酸纤维素膜装入杂交管中,贴壁放置(吸附有核酸的一面不要贴壁),赶走杂交膜和管壁间的气泡。
●加入20mlStandardbuffer,65℃预杂交4-20小时。
●将制备的DNA探针沸水浴加热10min,迅速置冰浴5min。
全部加入杂交管。
●使用和预杂交相同的杂交温度,一般杂交16-20小时。
●杂交结束后将杂交液倒入带盖的试管中,储存于-20以备下次使用。
这样至少可以保存一年。
再次使用之前应在冻融之后,加热至+95℃10分钟以变性探针。
●取出杂交膜,用WashSolutionI洗5分钟×3次。
●保温冲洗:
用WashSolutionII于68℃冲洗15分钟×2次。
NBT显色检测法:
●经过杂交及杂交后的冲洗之后,膜置于冲洗液中平衡1分钟。
●用干净的平皿,封闭液室温封闭至少60分钟。
●用封闭液1:
2500—5000稀释Anti-DIG-AP,例如2μlAnti-DIG-AP加至5-10ml封闭液中(根据染色情况而调整)。
稀释液4℃可稳定12小时左右。
●加Anti-DIG-AP,37℃反应60分钟。
●用冲洗液洗15分钟×3次,每次100ml。
●按1:
50配制底物显色液:
例如100μl“BCIP/NTP储备液”加至5ml显色缓冲液中,未用完的显色剂应避光保存。
●显色缓冲液20ml平衡2分钟后倾掉。
●加100ml底物显色液(100cm2)。
将膜及显色剂封在塑料袋中,开始避光显色。
显色过程中可以观察。
一般数分钟即开始出现颜色,显色过程可以持续至12小时。
应绝对避免震动,以免出现颜色带的移位。
●当所需要的显色点或带出现之后,蒸馏水洗以终止反应。
结果可以进行照相记录;也可以直接保存于TE缓冲液,在此情况下,颜色长期不退。
还有一种选择时让膜干燥,颜色消褪。
但若将膜放置于TE缓冲液中,显色重新出现。
五.实验结果及分析
图1中,共有16个条带,说明大家都提取成功了,只是右边几个亮度比其他的低,说明提取的DNA含量低一些。
图中有一些亮点,应该是胶上有杂质。
图质粒提取结果电泳检测
GFP质粒提取为8个人一组,所以上图共有四个条带,说明提取成功,而且亮度高,说明含量高。
上面图3中的第一张是班里的14个人的,后两张是另外14个人的,只是曝光时间不同。
三张图中的所有条带整齐而且亮度高,表明大家的P38质粒的PCR扩增很成功。
图质粒酶切结果检测
在酶切点样中,右边第一个为Marker,第二个为质粒,第三个为酶切,后面几个为质粒的PCR。
图中条带较整齐,有些亮度不够,可能是含量较低。
酶切条带与Marker的条带基本一致,但亮度稍低,含量较低,但总体来说酶切还是不错的。
图杂交显色结果
显色后,可以看到有两个PCR位点和酶切位点,一个质粒,说明杂交结果很好。
综合实验二.RT-PCR
扩增目的基因cDNA
(植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析;植物RNA提取、定量及电泳分析;RT-PCR扩增目的基因cDNA)
一.实验目的
1.掌握植物基因组DNA提取方法及注意事项,大分子量DNA分子的酶切分析。
2.掌握RNA提取的基本技术,了解RNA提取过程中的各种注意事项。
3.学习从细胞或组织的RNA中用逆转录PCR扩增目的基因的技术及操作。
二.实验原理
CTAB可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度时,从溶液中沉淀。
通过含有CTAB高盐抽提液使DNA充分溶出,然后加入氯仿使蛋白和细胞碎片沉淀,离心后,溶液分为三层,上层为CTAB与核酸的复合物的高盐溶液。
取出上清加入异丙醇使核酸沉淀。
RNA提取和DNA提取有类似的地方,因为它们都是核酸,都具有较好的水溶性。
提取RNA首先破碎细胞,然后用提取液将RNA溶出,反复抽提去除蛋白质,加入乙醇沉淀RNA,将RNA沉淀溶解备用。
逆转录PCR利用逆转录病毒依赖于RNA的DNA逆转录合成酶,在反义引物或oligo(dT)的引导下合成mRNA互补的DNA(complementalDNA),再按普通的PCR的方法用两条引物以cDNA为模板,扩增出不含内含子的可编码完整蛋白的基因。
这一DNA的5,和3,端经改造可直接用于基因工程的表达,因此逆转录PCR成为了目前获取目的基因的一条重要途径。
三.实验准备
1.实验材料:
普通小麦幼苗
2.实验试剂:
TtizolReagent,氯仿,点样缓冲液Loadingbuffer(10×),DEPC处理的ddH2O,溴乙啶(EB),异丙醇,RNA模板,cDNA引物,反转录缓冲液,dNTP,MMLV反转录酶,RNA抑制剂(RNasin),引物(P1、P2),Taq酶及10×PCR缓冲溶液,DNA抽提液,.氯仿:
异戊醇(24:
1),70%乙醇,EcoRⅠ酶,HindIII酶,TaqDNA聚合酶,10×反应缓冲液(含25mmolMgCl2)
3.实验仪器:
微量移液器,研钵,灌装液氮,台式离心机,电泳仪,凝胶成像系统,PCR仪,恒温水浴锅
四.实验步骤
的分离与纯化:
●称取小麦叶片400mg,于研钵中加液氮研磨成粉末,迅速转移到离心管中。
●加
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