生物化学教案上册Word文件下载.docx

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代提出的；

1955年，Sanger首次完成了牛胰岛素分子的一级结构分析；

1965年，我国生物化学家率先完成了结晶牛胰岛素分子的人工合成；

1965年，Monod提出了蛋白质

变构学说。

DNA重

4、近20多年来，酶工程、遗传工程、细胞工程都得到了快速发展。

其中组技术已成为当代最突出的科学成就之一。

三、本课程的内容组成

1、生物体的化学组成：

30种前提物质称为生物化学的字母表

20种氨基酸；

5种芳香族碱基，2种嘌呤（腺嘌呤和鸟嘌呤）和3种嘧啶（胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶）;

2种草糖，D-葡萄糖和D-核糖；

脂肪酸、甘油和胆碱。

由以上单位分子或它们的衍生物为基本单位组成的糖类、脂类、蛋白质、核酸以及对代谢起催化作用的酶、维生素和激素，通常被生物化学中的四大基本物质和三大活性物质。

2、代谢的研究

代谢是生物体与外界的物质和能量交换过程，是活细胞进行的复杂的系列酶促反应过程，包括同化作用和异化作用。

六类化学反应：

氧化还原反应、基团转移反应、水解反应、裂解反应、异构反应和合成反应。

3、遗传的分子基础及代谢调节

生物性状之所以能代代相传，是靠核酸和蛋白质作为物质基础。

DNA是遗传信息的载体，通过DNA分子的半保留复制，将遗传信息传递给子代，再通过蛋白质的生物合成将生物的遗传性状表达出来。

4、生化实验

生化是一门实验学科，生化理论本身就是通过实验研究发展起来的。

新技术的应用往往成为生化理论发展的关键。

1940年，瑞典的Svedberg发明了超速离心技术；

1937年Tiselins发明了电泳技术；

上世纪40年代英国化学家发明了纸上层析，Sanger对胰岛素的序列分析主要是依靠纸上层析技术完成的；

（1）分配色谱法的创立——快捷、经济的分析技术由Martin.Synge创立。

（2）Tisellius用电泳方法分离血清中化学构造相似的蛋白质成分。

吸附层析法分离蛋白质及其他物质。

（3）Svedberg第一台超离心机，测定了高度复杂的蛋白质。

（4）荧光分析法，同位素示踪，电子显微镜的应用，生物化学的分离、纯化、鉴定的方法向微量、快速、精确、简便、自动化的方向发展。

生化实验是生化课程内容的重要组成部分。

四、为什么要学习生化生物化学既是由多学科共同孕育形成并发展起来的边缘学科，又是生物及医、农各学科必不可少的基础学科；

既是在理论和技术方面都有很大影响的带头学科，又是涉及面很广的应用学科。

无论就其在自然科学中的地位来看，还是从其在国民经济建设中的作用来看，都是一门十分重要的学科。

使同学们了解生物化学发展的历史，掌握生命活动中重要组成成分—糖、脂、蛋白质、酶、核酸的结构和性质，了解维生素、抗生素、激素和生物膜组成、种类、性质和功能，对于生物体内分子水平上所发生各种代谢反应有较深入的认识，熟悉其中重要的生物化学反应过程，同时对生物体内的各种反应的规律有一个基本的认识，从而为学习其他的高等生物学课程打下良好的基础。

五、学习生化应注意的几个问题

1、建立起以生物功能为轴线的思维体系

生物化学的理论体系是以生物功能为轴线建立起来的，不同于无机化学以元素周期为基础的理论体系；

也不同于有机化学以官能基团为基础的理论体系。

从静态化学到动态化学都贯穿着生物功能这根轴线。

而且，分子结构和生物功能的关系更是生化讨论的内容。

2、注意学习技巧

3、要充分利用实验课的机会来提高分析问题、解决问题和动手的能力。

第一章蛋白质

重点：

氨基酸的分类、氨基酸的酸碱化学、氨基酸的化学反应、氨基酸混合物的分析分离；

肽、肽单位和肽平面、蛋白质一级结构的测定、稳定蛋白质三维结构的作用力、二级结构：

多肽链折叠的规则方式、超二级结构和结构域、球状蛋白质与三级结构、亚基缔合和四级结构；

蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀、蛋白质的分离纯化方法。

难点：

肽、肽单位和肽平面、多肽链折叠的规则方式、超二级结构和结构域、蛋白质

级结构的测定、蛋白质的分离纯化方法。

蛋白质是一类重要的生物大分子，蛋白质在生物体内占有特殊的地位，蛋白质和核酸是构成细胞内原生质的主要成分，而原生质是生命现象的物质基础。

蛋白质存在于几乎所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。

蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。

一、蛋白质的化学组成

蛋白质主要由C、H、O、N、S等元素组成，有些蛋白质还含有其它的一些元素，如铁、铜、锌等。

蛋白质的平均含氮量为16％，这是蛋白质元素组成的一大特定，也是凯氏定氮法测定蛋白质含量的基础。

测得含氮量之后，只要乘以6.25就可得到物质的蛋白含量。

二、蛋白质的水解

蛋白质的水解是研究蛋白质组成的重要方法。

蛋白质可以被酸、碱或酶催化水解，得到各种氨基酸或小的肽段。

根据蛋白质的水解程度可以分为完全水解和部分水解两种情况。

完全水解也称彻底水解，得到的是各种氨基酸的混合物。

部分水解也称不完全水解，得到的是各种大小不等的肽段和氨基酸。

水解的方法主要由酸水解、碱水解和酶水解三种。

1、酸水解

常用H2SO4或HCI。

一般用6mol/LHCI,4mol/LH2SO4，回流煮沸20h左右可使羟基氨基酸（丝氨酸和苏氨酸）部分分解，天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下来。

2、碱水解

一般用5mol/NaOH，煮沸10〜20h，可使蛋白质完全水解。

但多数氨基酸不同程度的被破坏，并产生消旋现象，得到D-和L-型氨基酸，能引起精氨酸脱氨形成鸟氨酸和尿素。

但色氨酸是稳定的。

3、酶水解

不产生消旋作用，不破坏氨基酸，但使用一种酶往往不能水解彻底。

需要几种酶的协同作用。

三、氨基酸

（一）a-氨基酸的一般结构

从不同天然蛋白质完全水解产物中分离到的20种基本氨基酸，称为常见氨基酸。

它

们的分子结构有两个共同的特点：

1、除脯氨酸是亚氨基酸外，其余19中氨基酸都是a-氨基酸，即与羧基相邻的碳原子（a-碳原子，Ca）上都有一个氨基，连接在a-碳原子上的还有一个氢原子和一个可变的侧链（R）,各种氨基酸的区别作于R的不同。

通式如图；

2、除了甘氨酸之外，都是L-型氨基酸。

甘氨酸的a-碳原子不是不对称碳原子，其它都是。

不对称碳原子是指与四个不同的原子或原子基团共价相连因而失去对称性的碳

原子。

也称手性碳原子、手性中心。

常用C*表示。

构型是指不对称碳原子的四个取代基

在空间的相对取向。

两种构型形成镜面异构，也叫旋光异构。

甘油醛C2为不对称碳原子，

其上的羟基有两种安排，羟基向左为L型，向右为D型。

DL与（＋－）不同。

记三字母简写式。

（二）氨基酸的分类

氨基酸分类的方式很多，可以从不同的角度去分。

1、根据R基团的不同可分为4类。

Gln、Asp、Asn、Lys、Arg共15种。

3）杂环氨基酸

包括His、Trp。

4）杂环亚氨基酸Pro。

2、根据R基团的极性不同可分为2类。

（1）非极性氨基酸

共9种。

Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pre、Trp、Met、Pro。

（2）极性氨基酸

1不带电荷的极性氨基酸

包括Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys，此组氨基酸比非极性氨基酸易溶于水，们带有不解离的基团可与水形成氢键。

2带负电荷的极性氨基酸

包括Asp、Glu，他们属于酸性氨基酸，在pH7时带负电荷。

3带正电荷的极性氨基酸

包括Arg、Lys、His，他们属于碱性氨基酸，在pH7时带正电荷。

（3）按酸碱性来分

①酸性氨基酸Asp、Glu。

②碱性氨基酸Arg、Lys、His。

3中性氨基酸其它氨基酸。

（4）人体是否能合成分

1必需氨基酸

人体不能合成，必需从食物中摄取的氨基酸。

包括Lys、Thr、Met、Val、Leu、Ile、

Trp、Pre。

2半必需氨基酸

成人能合成但新生儿不能合成的氨基酸。

包括His、Arg。

3非必需氨基酸

其它氨基酸。

（三）氨基酸的理化性质

1、两性解离和等电点

（1）概念

氨基酸分子中具有碱性基团氨基（-NH2）和酸性基团羧基（-COOH），在晶体或水溶液中主要以兼性离子的形成存在。

它即有酸的作用，又有碱的作用。

象氨基酸这种在同一分子中带有性质相反的酸、碱两种解离基团的化合物，称为两性化合物或两性电解

质；

两性电解质的解离受环境pH值的影响，改变环境的pH可以使氨基酸带上不同的电

荷，也可使它处于正负电荷相等的状态，此时氨基酸的净电荷为零，此时的pH称为氨

基酸的等电点。

在等电点时氨基酸的净电荷为零，在电场中既不向正极移动也不向负极移动。

而且此时氨基酸的溶解度最小，易发生沉淀。

各种氨基酸都有其特定的等电点，发酵生产中，可根据这种性质，从发酵液中提取并纯化各种氨基酸。

（2）等电点的计算

1侧链不解离的氨基酸

pl=0.5x（pKa1+pKa2）

2酸性氨基酸

3碱性氨基酸

pl=0.5x（pKa2+pKa3）

2、氨基酸的化学反应

（1）a-氨基参加的反应

1与亚硝酸反应

脱氨形成N2,N2中的N—半来自氨基，此法可用于氨基酸的定量测定。

2与酰化试剂反应

氨基被酰基化，如与苄氧甲酰氯等反应。

此类试剂在多肽和蛋白质的人工合成中被

用作氨基的保护剂。

3烃基化反应

氨基的一个氢可被烃基取代，如2,4-二硝基氟苯（DNFB,FDNB）在弱碱性溶液中形成二硝基苯基氨基酸（DNP-氨基酸），此反应被Sanger用于鉴定蛋白质的N末端氨基酸。

再如与苯异硫氰酸酯（PITC）在弱碱性条件下形成苯氨基硫甲酰（PTC）衍生物，

此衍生物在硝基甲烷中与酸反应生成苯乙内酰硫脲（RTH）衍生物。

这个反应被Edman用于鉴定蛋白质N端氨基酸。

在多肽和蛋白质序列测定放面占重要地位。

4形成西佛碱反应

与醛反应生成西佛碱。

5脱氨基反应

氨基酸在体内经氨基酸氧化酶等催化脱去a-氨基，形成酮酸（见下册）。

（2）a-羧基参加的反应

1成盐和成脂反应

与碱成盐与醇成脂，具有保护羧基作用，同时使氨基活化，易与酰基或羟基反应，这就是为什么氨基酸的酰基化和羟基化需要在碱性溶液中进行的原因。

2成酰氯反应与二氯亚砜或五氯化磷反应生成酰氯。

可使氨基酸的羧基活化，在多肽人工合成中

常用。

3脱羧基反应

经氨基酸脱羧酶作用放出二氧化碳并生成一级氨。

4叠氮反应

氨基酸的氨基通过酰基化加以保护，羧基经酯化转变为甲酯，然后与肼和亚硝酸反

应即变为叠氮化合物。

此反应使氨基酸的羧基活化，常用于肽的人工合成。

（3）a-氨基和a-羧基共同参与的反应

1与茚三酮反应

NH3,

茚三酮在弱酸性溶液中与a-氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氨、脱羧反应，最后茚三酮与反应产物氨和还原茚三酮发生作用，生成紫色物质。

颜色的深浅与氨基酸的浓度成正比，利用此反应可以定性或定量氨基酸。

利用茚三酮显色可以定性鉴定并用分光光度法在570nm定量测定各种氨基酸。

脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应不释放而直接生成亮黄色化合物，最大光吸收在440nm。

2成肽反应

一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基可以缩合成肽，形成的键称肽键。

3羰氨反应

氨基酸的氨基与糖类的羰基易发生反应，生成羰氨化合物，进而缩合成更复杂的棕

色到黑色化合物“类黑色素”。

食品加工中将这种反应称为褐变。

原料褐变后不仅影响原料的利用率，还有很多毒副作用。

（4）侧链R基参加的反应

很多基团参与反应，其中一些是蛋白质化学修饰的基础，所谓蛋白质的化学修饰就是在较温和的条件下，以可控的方式使蛋白质与某种试剂（称化学修饰剂）起特异反应，以引起蛋白质中个别氨基酸侧链或功能团发生共价化学改变。

化学修饰在蛋白质的结构与功能的研究中是很有用的。

1酪氨酸的酚基在3和5位易发生亲电取代反应，还可以与重氮化合物结合生成橘黄色的化合物。

2组氨酸的咪唑（ZUO）基与重氮苯磺酸反应形成棕红色化合物。

3精氨酸的胍基在硼酸钠缓冲液中与1,2-环己二酮反应生成缩合物，此缩合物在羟

胺缓冲液中可重新生成精氨酸。

4色氨酸的侧链吲哚基在温和的条件下可被N-溴代琥珀酰亚胺氧化，此反应可用于

分光光度法测定蛋白质中色氨酸的含量。

5蛋氨酸侧链上的甲硫基是一个很强的亲核基团，可与烃化试剂如甲基碘反应形成

锍盐。

6半胱氨酸的巯基反应性能很高，在微碱性环境中-SH可解离为硫醇阴离子，能与

卤化烷如碘乙酸、甲基碘等反应生成稳定的烷基衍生物。

半胱氨酸的巯基能打开乙撑亚

胺（氮丙啶）的环，生成的侧链带有£

-NH3，它为胰蛋白酶水解肽链提供了一个新的位

点。

巯基还能和各种金属离子形成络合物。

由于许多蛋白质（酶）的活性中心有-SH，当

遇到重金属离子而生成硫醇盐时将导致酶的失活。

半胱氨酸可与二硫硝基苯甲酸（DTNB）或称Ellman试剂发生硫醇-二硫化物交换反应，1分子半胱氨酸引起1分子硫硝基苯甲酸的释放，它在pH8.0时，在412nm波长处有强烈的光吸收，因此可以利用分光光度计定量测定-SH的含量。

巯基易被氧化形成-S-S-，二硫键在稳定蛋白质的构象上起重要作用。

（四）氨基酸的光谱性质

组成蛋白质的氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在红外区和远紫外区（入

<

200nm）。

但在近紫外区（200-400nm）只有芳香族氨基酸有吸收光的能力，酪氨酸

的Imax=275nm，苯丙氨酸的Imax=257nm，色氨酸的Imax=280nm。

蛋白质由于含有这些氨基酸，所以也有紫外吸收的能力，一般最大吸收在280nm波长处，因此利用分光光度法可以很方便的测定蛋白质的含量。

（五）氨基酸的分析分离目前分离氨基酸的方法主要是层析技术。

1、分配层析的一般原理

层析即色层分析也称色谱。

所有的层析系统都由2个相组成，一个为固定相或静相，一个为流动相或动相。

混合物的分离决定于该混合物的组分在两相中的分配情况。

这种分配情况我们一般用分配系数来描述。

1891年Nernst提出了分配定律：

当一种溶质在两种给定的互不相容的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比值为一常数，即分配系数（Kd）。

Kd=CA/CB.

物质在层析系统中的行为并不直接决定于它的分配系数Kd，而是取决于有效分配系

数Keff。

Keff=某一物质在A相中的总量/该物质在B相中的总量。

对于液相-液相层析系统来说：

Keff=（CaXVa）/（CbXVb）=KdXRv

Rv：

A、B两相的体积比。

利用层析分离氨基酸混合物的先决条件是各种氨基酸成分的分配系数要有差异，哪怕是很小的差异，一般差异越大，越容易分开。

逆流分配法说明层析的原理。

一系列试管加互不相容的两相，加入物质Y（Kd=1）

和Z（Kd=3）。

见书P149。

2、分配柱层析

在层析柱中加入填充物或称支持剂，这些填充物都是一些具有亲水性的不溶物质，如纤维素、淀粉、硅胶等。

支持剂吸附着一层不流动的结合水可以看作为固定相，沿着固定相流过的与它互不相容的溶剂（如苯酚、正丁醇等）是流动相。

由填充料构成的柱床可以设想为由无数板层组成，每一板层起着微观“分溶管”的作用。

当用洗脱剂洗脱时，即流动相移动时，加在柱上端的氨基酸混合物样品在两相之间将发生连续分配，混合物中具有不同分配系数的成分沿柱以不同的速度向下移动。

分步收集柱下的洗脱液。

用茚三酮显色，以氨基酸量对洗出液体积作图，得到洗脱曲线，曲线中的每个峰相当于某一种氨基酸。

3、纸层析

纸层析也是分配层析的一种，滤纸纤维素上吸附的水为固定相，展层用的溶剂是流

动相。

层析时混合氨基酸在两相中不断的分配，使他们分布在滤纸的不同部位。

步骤：

混合物点在滤纸的一角，称原点。

然后在封闭容器中用一个溶剂系统沿滤纸

一个方向展层。

烘干后，旋转90C,再用另一个溶剂系统进行第二向展层。

由于各种氨

基酸在两个系统中的Rf值不同，而彼此分开。

茚三酮显色得出双向纸层析谱。

Rf值=X/Y

X:

从原点至氨基酸停留点的距离;

;

Y:

与原点至溶齐U前沿的距离。

4、薄层层析

将支持剂涂布在玻璃板上，形成一个均匀的薄层，把要分析的样品滴加在薄层的一端，然后用合适的溶剂在密闭的容器中展层。

薄层层析分辨率高，所需样品少，层析速度快。

5、离子交换层析

支持剂是离子交换树脂。

离子交换树脂是具有酸性或碱性的人工合成的聚苯乙烯苯二乙烯等不溶性高分子化合物。

这些化合物都是具有网状结构的高聚物。

这些高聚物上引入一些带电基团就成为离子交换树脂。

离子交换树脂分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂两类。

阳离子交换树脂分强酸型（-SO3H）和弱酸型（-COOH）两类，可解离

出H+，当溶液中含有其它阳离子时可以和H+发生交换，而结合在树脂上。

阴离子交换

树脂有强健型（-N（CH3）3OH）和弱碱型（-NH3OH）两类，可解离出OH-，当溶液中含有其它阴离子时可以和OH-发生交换，而结合在树脂上。

分离氨基酸混合物经常用强酸型树脂，氨基酸与树脂结合的牢固程度主要取决于氨基酸与树脂的静电吸引，即氨基酸所带的电荷。

在pH3左右，氨基酸与阳离子交换树脂的静电吸引的大小次序是碱性氨

基酸＞中性氨基酸＞酸性氨基酸。

通过改变洗脱液的pH，可以改变氨基酸的带电情况，

从而使氨基酸从离子交换树脂上洗脱下来。

除上述方法之外还有气相色谱和液相色谱，较先进。

四、蛋白质的一级结构

（一）一级结构的含义

一级结构又叫初级结构指的是肽链中的氨基酸的组成和排列顺序。

一级结构是高级

结构的化学基础，也是认识蛋白质分子生物学功能、结构与生物进化的关系、结构变异

与分子病的关系等许多复杂问题的重要基础。

（二）多肽链

肽键一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基所成的酰胺键，在蛋白质化学中称为

肽键，肽键是一个酰胺键，由于酰胺键氮上的孤对电子与相邻羰基之间的共振相互作用，

表现出高稳定性。

组成肽键的C-N键，具有40%双键的性质，不能自由旋转。

肽键中的四个原子和它们相邻的2个a-碳原子都处于同一平面上，此刚性结构的平面称为肽平

或肽酰平面，其中H和0处于C-N键的两侧形成反式。

很多氨基酸依次通过肽键连接而形成的链状结构称为多肽链。

由2个氨基酸组成的肽称为二肽，三肽以上根据含氨基

酸的多寡称为寡肽、多肽。

蛋白质就是由几十个到几百个甚至上千个氨基酸组成的多肽。

肽链的骨干是由-NH-HCR-CO-单位规则的重复排列而成，称之为共价主链。

在多肽链

中两个氨基酸失去一分子水形成肽键，故已经不是原来完整的分子，因此称为氨基酸残

基。

多肽链通常含有一个游离的末端氨基和一个游离的末端羧基，称为氨基末端（端）和羧基末端（C末端）。

书写多肽链时，一般是将N末端写在左边，C末端写在右边。

多肽的命名是根据参与其组成的氨基酸残基来确定，规定从肽链的N末端残基开始，称

为某氨基酰某氨基酰某氨基酸。

多肽链的共价结构除了肽键外，还有二硫键，即肽链上的两个半胱氨酸残基的巯基脱氢形成，又称“硫桥”，二硫键对蛋白质的空间结构非常重要。

（3）一级结构分析

1、一般程序

多肽链的氨基酸测序主要是根据英国F.Sanger实验室中发展起来的方法进行测定

的，这个方法首先应用于胰岛素的氨基酸序列的测定，Sanger因此获得1958年诺贝尔

奖。

现在常用的氨基酸序列分析仪是根据Edman反应原理发展起来的。

只简要的介绍蛋

白质序列测定的一般步骤。

（1）测定蛋白质分子中多肽链的数目，根据N末端和C末端的数量。

（2）拆分蛋白质分子的多肽链

（3）断开多肽链内的二硫键，一般用甲酸氧化或巯基化合物还原。

（4）分析每一多肽链的氨基酸组成，一部分样品完全水解，测定氨基酸组成，并计算氨基酸成分的分子比。

（5）鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基，建立两个氨基酸序列的参考点。

（6）断裂多肽链为较小的片段

7）测定各肽段的氨基酸序列，目前常用Edman降解法。

（8）根据上述个肽段的氨基酸序列测定结果，利用两套或几套肽段的序列彼此间的交错重叠，可拼凑出整条多肽链的氨基酸序列。

（9）确定二硫键的位置。

2、N末端和C末端氨基酸残基的测定

（1）N末端的分析方法

1二硝基氟苯（DNFB或FDNB）法

多肽或蛋白质的游离末端NH2与DNFB反应后，生成DNP-多肽或蛋白质。

由于

DNFB与氨基形成的键对酸水解的稳定性比肽键高，因此DNP-多肽经水解后，只有N末端氨基酸为黄色DNP-氨基酸衍生物，其余的都是游离氨基酸。

只要鉴别生成的DNP-氨基酸便可知多肽链的N末端残基。

2丹磺酰氯法

丹磺酰氯是二甲氨基苯磺酰氯的简称，所写DNS。

原理与DNFB法相同，由于丹磺酰氯具有强烈的