高效液相色谱法测定双黄连口服液中绿原酸黄芩苷连翘苷汉黄芩苷的含量Word格式.docx
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高效液相色谱法测定双黄连口服液中绿原酸黄芩苷连翘苷汉黄芩苷的含量Word格式.docx
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黄芩苷在~μg范围内线性关系良好(r=1),平均回收率为%;
连翘苷在~μg范围内线性关系良好(r=3),平均回收率为%;
汉黄芩素在~μg范围内线性关系良好(r=1),平均回收率为%。
结论本方式简即可行、准确、快速,可用于双黄连口服液中上述4种成份的含量测定。
【关键词】双黄连口服液 绿原酸 黄芩苷 连翘苷 汉黄芩素 高效液相色谱法 含量测定
Abstract:
ObjectiveToestablishaHPLCmethodforthedeterminationofchlorogenicacid,baicaliin,forsythinandwogonininShuanghuanglianoralliquid.MethodsThecolumnwasVP-ODSC18(250mm×
mm,5μm).Themobilephaseconsistedof%phosphoricacidwithgradientelution.TheflowratewasmL/minandthedetectionwavelengthwasat278nm.ResultsThecalibrationcurveswerelinearwithintherangeof~μg(r=1)forchlorogenicacid,~μg(r=1)forbaicaliin,~μg(r=3)forforsythin(r=3)and~μg(r=1)forwogonin,respectively.Theaveragerecoveryofthemwere%(RSD=%),%(RSD=%),%(RSD=%)and%(RSD=%),respectively.ConclusionThemethodissimple,practicable,accurateandrapid.Itcanbeappliedtocontentdeterminationofchlorogenicacid,baicaliin,forsythinandwogonininShuanghuanglianoralliquid.
Keywords:
Shuanghuanglianoralliquid;
chlorogenicacid;
baicaliin;
forsythin;
wogonin;
HPLC
双黄连口服液由金银花、黄芩及连翘经提取精制而成,具有辛凉解表、清热解毒功效,关于上呼吸道感染、扁桃体炎、咽炎、病毒性肺炎等细菌和病毒感染性疾病有必然疗效。
其中绿原酸、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩素是其要紧活性成份。
2005年版《中华人民共和国药典》(一部)采纳高效液相色谱法只测定了绿原酸、黄芩苷、连翘苷的含量[1],而且是采纳包括甲醇-醋酸-水、乙腈-醋酸-水的不同流动相别离测定。
本实验参照文献[2],通过优化色谱条件,成立了不经提取分离,利用梯度洗脱法同时测定上述4种成份含量的高效液相色谱法,具有简即可行、准确、快速的特点,减少了配制流动相的步骤和进样次数,提高了工作效率,取得了中意成效。
1仪器与试药
岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪;
SPD-10Avp紫外可见检测器;
CLSS-VP色谱工作站;
CTO-10ASvp柱温箱;
7725i手动进样器。
绿原酸对照品(批号)、黄芩苷对照品(批号)、连翘苷对照品(批号)、汉黄芩素对照品(批号)均由中国药品生物制品检定所提供。
双黄连口服液由中国人民解放军252医院药剂科提供,批号、、。
甲醇、乙腈均为色谱纯,磷酸为分析纯,水为三蒸水。
2方式与结果
色谱条件与系统适应性实验
色谱柱:
岛津VP-ODSC18柱(250mm×
乙腈(A)%磷酸溶液(B)(A+B=100%)作梯度洗脱,t=0→6min,A:
27%;
t=6→10min,A:
30%;
t=10→15min,A:
60%;
t=15→25min,A:
90%;
278nm;
柱温:
25℃;
进样量20μL。
在上述色谱条件下,4种待测组分与临近组分达到了基线分离,理论塔板数按绿原酸峰计算不低于3000。
溶液的制备
对照品溶液的制备
周密称取绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素对照品适量,置10mL容量瓶中,加50%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,别离制成浓度为、、、mg/mL的对照品母液。
供试品溶液的制备
周密吸取双黄连口服液mL,置50mL容量瓶中,加50%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,μm微孔滤膜过滤,即得。
阴性对照溶液的制备
按处方比例及制备工艺,别离制备缺金银花、黄芩、连翘的阴性对照样品,按供试品溶液的制备方式制成阴性对照品溶液。
线性关系考察
别离周密吸取绿原酸对照品母液、、、、mL,黄芩苷对照品母液、、、、mL,连翘苷对照品母液、、、、mL,汉黄芩素对照品母液、、、、mL,对应加入10mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,配制成5个浓度的混合对照品溶液,进样测定,记录色谱图。
以峰面积为纵坐标,别离以绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素进样量为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程。
绿原酸:
Y=×
107X+×
105,r=6;
黄芩苷:
106X-×
104,r=9;
连翘苷:
105X+×
汉黄芩素:
106X+×
105,r=9。
结果说明,绿原酸进样量在~μg范围内,黄芩苷进样量在~μg范围内,连翘苷进样量在~μg范围内,汉黄芩素进样量在~μg范围内,线性关系良好。
周密度实验
周密吸取绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素混合对照品溶液注入液相色谱仪,持续进样5次,绿原酸峰面积RSD=%,黄芩苷峰面积RSD=%,连翘苷峰面积RSD=%,汉黄芩素峰面积RSD=%。
结果说明,所选方式周密度良好。
稳固性实验
周密吸取同一供试品溶液,别离在0、二、4、六、八、10、1二、24h进样,测定样品中绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素的峰面积,结果绿原酸RSD=%,黄芩苷RSD=%,连翘苷RSD=%,汉黄芩素RSD=%,说明样品溶液在24h内稳固。
重复性实验
周密称取同一批号5份样品,按供试品溶液制备方式制备,进样,记录峰面积,结果绿原酸RSD=%,黄芩苷RSD=%,连翘苷RSD=%,汉黄芩素RSD=%,说明方式重复性良好。
阴性对如实验
别离取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液,按“”项下色谱条件进样测定,绘制色谱图。
结果阴性对照溶液在供试品溶液及对照品溶液中绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素保留时刻相应位置上均无吸收峰显现,说明阴性对照无干扰。
加样回收率实验
周密量取同一批号mL双黄连口服液4份于50mL容量瓶中,别离加入绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素对照品溶液适量,加50%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,μm微孔滤膜过滤。
按“”项下色谱条件进样测定其含量,计算加样回收率,结果见表1。
表1绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素回收率测定结果(略)
样品含量测定
取3批样品,按“项下方式别离制成供试品溶液,周密吸取对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪,按“”项下色谱条件测定,用外标法计算样品中绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素的含量,结果见表2。
表2样品含量测定结果(略)
3讨论
供试品溶液制备方式的选择
2005版《中华人民共和国药典》(一部)高效液相色谱法测定绿原酸的含量时对供试品溶液处置采纳加水稀释样品的方式,测定黄芩苷的含量时采纳50%甲醇超声处置20min,测定连翘苷的含量时采纳过中性氧化铝柱洗脱。
文献报导也多采纳上述方式[3-6]。
咱们在实验中观看到:
50%甲醇超声处置20min与50%、100%甲醇溶解、过滤所得色谱峰的峰面积结果无明显区别,而溶解过滤操作更为简便易行,因此,选择甲醇溶解过滤供试品。
制备供试品溶液利用纯甲醇和50%甲醇做溶剂所得色谱峰的峰形、峰面积均无明显区别,从节约本钱的角度动身,本实验最终选择50%甲醇溶解、过滤制备供试品溶液。
检测波长的选择
本实验对绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素4种对照品进行了200~400nm紫外光谱扫描,结果说明,绿原酸在218nm处有较强的吸收,在240nm和295nm处有次强吸收;
黄芩苷在278nm处有较强的吸收,在315nm处有次强吸收;
连翘苷在228nm处有较强的吸收,在278nm处有次强吸收;
汉黄芩素在278nm处有一个最大吸收峰。
考虑到连翘苷和汉黄芩素在样品中含量较低,而绿原酸和黄芩苷在样品中含量较高,为了提高连翘苷和汉黄芩素检测灵敏度,以选择汉黄芩素的最大吸收波长278nm作为检测波长,提高汉黄芩素的检测灵敏度,减少4个成份峰之间峰高的不同。
流动相的选择
咱们在实验中发觉,甲醇与水混合压力明显增高,而乙腈一样与水混归并非如此。
与甲醇相较,乙腈的洗脱能力强,且粘度较小,柱压大小比较适合,能够知足色谱系统流速在mL/min条件下检测的要求,而且系统分离成效较好,峰形对称,柱效高,保留时刻适宜。
因此,综合来看,乙腈-水系统要优于甲醇-水系统。
实验中观看到,乙腈-磷酸比乙腈-水做流动相所得的色谱峰要略微灵敏,拖尾减少。
而且,咱们曾经尝试对磷酸的浓度进行%~%调剂,发此刻此范围内对峰形的转变无明显阻碍,从爱惜色谱柱的角度考虑,决定采纳乙腈-%磷酸溶液作为流动相。
洗脱方式的选择
本制剂为中药复方,成份较复杂,且黄芩苷与汉黄芩素别离为黄酮苷和黄酮苷元,极性不同较大,采纳等度洗脱法难以达到有效分离。
曾选用乙腈%磷酸(30∶70)的色谱条件,绿原酸与临近组分分离成效不佳,而汉黄芩素的对照品在40min左右出峰,保留时刻明显延长,样品溶液在同一保留时刻里未发觉相应的色谱峰。
采纳梯度洗脱的方式,在检测进程的前6min维持乙腈的比例为27%,使绿原酸与临近组分达到基线分离;
6~25min将乙腈的比例慢慢提高到90%,一方面缩短汉黄芩素的出峰时刻,更重要的是通过大幅度增加乙腈的浓度来提高洗脱成效,结果汉黄芩素对照品在min左右出峰,供试品与对照品在同一保留时刻里有一相应的色谱峰,分离成效较好,峰形对称。
在此条件下,黄芩苷和连翘苷的保留时刻适宜,峰形对称,分离度好,从而能够将上述4种成份同时测定。
【参考文献】
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:
化学工业出版社,-406.
[2]金永新,要林青,杨晓冬,等.RP-HPLC法同时测定复方鱼腥草片中绿原酸、连翘苷、黄芩苷的含量[J].中国药师,2004,7(7):
524-526.
[3]刘芳.高效液相色谱法测定双黄连口服液中绿原酸的含量[J].湖北中医杂志,2003,25(9):
46-47.
[4]陈玉谊.HPLC测定双黄连口服液中黄芩苷的含量[J].海峡药学,2003,15(4):
47-48.
[5]张玉洁,黄海欣.HPLC测定双黄连口服液中连翘苷的含量[J].华西药学杂志,2005,20(4):
360-361.
[6]方崇波.高效液相色谱法测定双黄连口服液中绿原酸和黄芩苷的含量[J].医药导报,2004,23(12):
951-952
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- 高效 色谱 测定 双黄 口服液 中绿原酸 黄芩 连翘 含量