第01章 新药临床研究总论Word文档格式.docx
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显然,广泛筛选便成为药物发现的主要方式。
药物筛选是主动寻找药物的过程。
所谓筛选,就是对可能作为药用的物质,采用适当的方法进行实验,发现其药用价值。
筛选的对象是可能作为药用的物质,因此,收集被筛选的物质(样品)越多,发现新药的可能性越大。
筛选的方法就是能反映药物作用的技术手段,这些技术手段越灵敏越可靠,漏筛的可能性就越小。
筛选药物的策略多种多样,下面是几种常见的方式。
(一)定向筛选
所谓定向筛选,就是采用特定的方法,专门筛选防治某种疾病的药物。
这种方法是现代医学研究过程中长期使用的方法,并在药学研究中取得了巨大的成就,如治疗心血管系统疾病的药物,抗肿瘤药物等等。
但对于被筛选的物质来讲,却不能全面反映出其内在的作用。
因此,理想的方法是在定向筛选的同时能够实现一药多筛,从多方面发现这些物质的作用。
(二)筛选特定样品
这种筛选方法的特点在于利用了已有信息,在特定的样品范围内进行筛选。
例如抗生素类药物的筛选,就是根据青霉素的来源作为借鉴,以多种细菌的产物作为样品,筛选其抗菌活性,从而发现了大量新的抗生素药物。
我国目前对中药的研究也是采取这种方法,根据中药已有的相关信息,选取对某类疾病可能有效的物质,筛选其有效成分。
采用这种方式筛选,具有较高的成功率,但由于筛选范围受到限定,特别是所依据的信息资料不可能都有代表性,也可能产生误导。
(三)比较筛选
比较筛选是根据对现有药物的认识,获得结构或性质相似的样品,采用确定的模型进行筛选,由此发现同类型而作用更好的新药物。
这种方法主要用于模仿(me-too)创新药的研究,成功率也较高,但是难以产生原始创新药物。
(四)随机筛选
所谓随机筛选,就是采用不同的方法,对可能作为药用物质样品进行药理活性的广泛筛选。
这种筛选方法是新药发现的最基本方式,也是在医药发展过程中实际存在的方式。
从原始阶段人类寻找药物到目前对新化合物的各种生物活性测试,实际上都是随机筛选。
随机筛选的特点是能够发现全新的药物,但同时其成功率是不可预测的。
要提高药物随机筛选的成功率,就要保证足够的筛选样品量和广泛的筛选方法。
二、先导化合物的结构改造
先导化合物是指已具有初步活性的化合物分子,它可以是已经上市的现有药物,也可以是业已被发现具有明显药理活性或作用特点的合成或天然化合物,其中有些是经过广泛筛选后得到的。
运用现代药物设计方法可以对先导化合物进行优化,以便进一步提高活性、降低毒性、增加特异性或改善药代动力学特性等。
这种方法是新药研究与开发的经典方法,通常称为“间接合理药物设计”,即在不清楚药物作用靶结构的情况下,通过对分子三维结构与生物活性之间构效关系的研究,来指导药物设计的方向。
这是一个多轮次重复的过程,而每一轮都将会提供一些有用的信息给下一轮药物设计使用。
这种研究方法,结合综合活性筛选,有时还会发现意料之外的新活性,从而成为另一种治疗领域的药物或先导化合物。
三、合理药物设计
合理药物设计(rationaldrugdesign)是依据生物化学、酶学、分子生物学及遗传学等生命学科的研究成果,针对这些基础研究中所揭示的包括酶、受体、离子通道及核酸等潜在药物作用靶位,再参考其内源性配体或天然底物的化学结构特征设计药物分子,以发现选择性作用于靶位的新药,这些药物往往具有活性强、作用专一,且副作用较低的特点。
而传统新药多是经偶然观察或对大量天然物质和合成物质进行系统筛选后发现的,这种方法发现的药物由于缺乏对药物作用靶特征的了解及作用环节多,选择性不是很高,因此往往活性很低,毒副作用较大。
合理药物设计分为直接设计和间接设计(模拟)。
直接设计是指在已知靶物质三维结构的情况下进行的药物分子设计。
一般的方法是测定酶和受体的蛋白质晶体结构,常用的方法是X衍射晶体测定法和高精度的核磁共振法,然后将亲和力和活性最强的底物与酶或受体嵌合形成复合物后,再测定复合物的晶体结构或在溶液中的三维结构,这样即可了解到药物和靶相互作用的三维模式,在此基础上再进行先导物分子结构修饰,也可进行所谓的全新药物分子设计(denovodrugdesign),即设计出与先导物结构完全不同的新化合物分子。
间接设计方法是在未知靶物质结构的情况下,利用药物分子与靶物质间的互补性,探索一系列药物的三维结构与生物活性的定量关系,即根据已知生物活性化合物的结构,反推未知靶物质的结构和性质,或利用结构已知的同族类似靶物质推测其活性部位的空间结构,然后再利用所推测的靶物质结构和性质设计新化合物。
四、模仿创新
采用模仿(me-too)方法寻找新药就是在别人专利药物的基础上,对化学结构加以修饰和改造,研究出自己的专利药物,新药研究开发的模仿方法,是当今世界各国广泛采用的战略,即使是实力很强的大公司也不例外,因为这种方法投资少,周期短,成功率高,其市场实际上还是很可观的。
模仿方法研究开发新药已经取得了巨大的成功。
例如SmithKline根据H2-受体拮抗剂理论,成功开发出西咪替丁(cimitidine),于1976年投放市场。
Glaxo的科学家们得知关于H2-受体拮抗剂有研制成功新药的可能性后,于是他们决定参与竞争。
终于在1981年推出了他们稍加改造的类似物雷尼替丁,成为世界最畅销的药品,年销售量达30多亿美元。
之后,Merk又推出了疗效更高的法莫替丁(famotidine)。
又如,血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂的开发,大量的早期工作是在各大学完成的,当时并没有引起人们的商业追求。
后来,Squibb逐渐发生了兴趣,直到70年代后期才开发成功了卡托普利(captopril)。
紧跟着,Merk就推出了依那普利(enalapril),该品种由于去掉了分子中的巯基,增强了与酶结合的强度,故毒性小,作用持久。
依那普利在1995年全球销售额达23亿美元。
这两个药物成为80年代高血压和充血性心力衰竭治疗的主药。
90年代初,B-MSauibb又上市了福辛普利(fosinopril),成为第三代血管紧张素转化酶抑制剂的代表。
五、手性均一体创新
手性药物是指只含单一旋光异构体的药物。
由于许多药物作用过程涉及药物与机体生物大分子之间的手性匹配,近十年来手性药物的研究开发引起了人们的极大兴趣,并成为医药工业研究开发的新领域。
美国、英国、瑞士、瑞典等国相继颁布了关于手性药物的法规,要求凡带有手性中心的新药物分子,必须要进行不同对映体之间的活性对比研究,以确定其最终药用形式。
手性药物在药效学性质上存在以下四种情形:
(1)异构体具有完全不同的药理作用。
例如,反应停(thalidomide)的S―构型为镇静剂,R―构型无镇静作用而有致畸作用;
乙胺丁醇(ethambutol)的S,S―构型具有抗结核菌作用,而R,R―构型则可导致失明;
喘速宁(trimethoquinol)其S―构型为支气管扩张剂,R―构型则具有抑制血小板凝聚作用。
(2)异构体中一个具有药理活性,另一个没有药理活性。
例如:
甲基多巴(methyldopa)只有S―构型具有抗高血压作用。
(3)两个异构体虽药理作用类型相同但作用强度不同。
例如,心血管系统药物普萘洛尔(propranolol),其S―异构体的β―受体阻断作用比R―异构体强约100倍;
抗炎镇痛药萘普生(neproxen),其S一异构体疗效为R一异构体的28倍。
(4)两个异构体的药理作用类型和作用强度完全相同。
这种情况一般是手性中心不参与受体结合或仅存在非特异性作用的情况。
例如,异丙嗪(promethazine)的两个异构体具有相同的抗组织胺活性和毒性。
对手性药物的评价研究,可以发现不同对映体的药理学特性,为开发疗效好、副作用小、治疗成本低的手性药物提供依据,也将对阐明药物作用机理、预测药物疗效和毒性、发现新的作用类型和适应症提供帮助。
据统计,目前世界药品市场共约1,700种药物(原料药)中,含有手性的药物占57%,但目前仅有20%以单一对映体作为药用,其余80%仍以外消旋体用于临床。
不过开发单一异构体药物的机会越来越少了,首要的原因就是自1990年代初期开始,美国食品药物管理局(FDA)就鼓励大制药公司开发单一异构体药物,代替消旋体上市。
因此,今后对于手性化合物的开发机会在于从现有药物中分离母体药物的活性代谢物。
当然,从长远观点来看,最根本的战略还是发现新化学实体。
第二节 新药研究技术
一、组合化学技术
组合化学(combinatorialchemistry)是由Furka等于1988年首先提出的,但直至1991年在一次专门的讨论会上才正式应用这一名词。
组合化学是一种合成策略,目的是建立大型化合物库,因此组合化学可定义为在不同结构的构建块之间以共价键系统、反复地进行连结,从而产生一批不同的分子实体的方法。
组合化学概念的提出是对传统有机合成以及活性物质筛选观念的挑战。
长期以来,化学家们认为化合物要逐一合成、纯化、鉴定其结构,然后进行生物活性的测定,但这种方法效率低、速度慢,使得新药开发成本越来越高,周期越来越长;
而组合合成方法可以利用有限的反应,同时合成大量的化合物,一个组合库可以包括从几十到几百万甚至上千万或更多个化合物,生物活性测定可以对一种化合物进行,更多情况下是对未经纯化的混合组分进行筛选。
有人作过这样的比喻,如果把包括1024个化合物库中的每一个化合物放入微孔板的一个小孔中,结果是,这个库将覆盖整个美国,并且其厚度是30个帝国大厦高。
如果我们真的得到了这样一个库,进行逐一筛选也是没有意义的。
那么如何快速筛选出活性成分,就成为组合化学家必须面对的问题。
组合化学打破了传统合成化合物的模式,是用固相合成法合成许多化合物或者它们的混合物,先进行药理筛选,再证明活性化合物的结构,此法用于新药研究不仅快速、有效,而且节约人力、物力,因此,组合化学的产生被认为是合成领域的一次“工业革命”,世界上几乎所有的大制药公司和大学都开展了此项研究,并在短短的几年中,取得了许多令人瞩目的成就。
根据这种趋势,有理由相信,组合化学必将成为下个世纪寻找新药的最主要的途径之一。
二、反义技术
反义核酸包括反义DNA、反义RNA和酶性核酸三种,它们可特异性地作用于靶基因或其相应的mRNA,从基因复制、转录、剪接、转运和翻译等各个环节上调控基因的表达,从而实现疾病的治疗。
药物的研究与开发取决于两个重要的参数:
首先是要确定疾病发展过程中的合适靶点;
其次是发现能特异性识别并能结合于该靶点上的化合物,从而干预疾病的发展过程。
以往使用的靶点绝大多数是蛋白质、酶和激素。
反义核酸作为药物与常规药物相比有两个优点:
①有关疾病的靶基因mRNA序列是已知的,因此,设计、合成特异性的反义核酸比较容易;
②反义寡核苷酸与靶基因能通过碱基配对原理发生特异和有效的结合,从而调节基因的表达。
它的缺点是天然的寡核苷酸难以进入细胞内,而一旦进入又易于被胞内核酸酶水解,很难直接用于治疗。
为此人们采用药物化学的原理和方法,对天然寡核苷酸进行化学修饰,以达到治疗药物的要求。
福米韦森(fomivirsen,Vitravene)1998年已由美国FDA批准上市,用于二线治疗艾滋病所致细胞病毒(CMV)视网膜炎,这是全球获准上市的第一个反义药物。
随着福米韦森的上市,以及包括ribozym类的新一代反义药物进入临床,反义药物的研究与开发将会取得飞速的发展。
三、高通量筛选技术
高通量药物筛选 (Highthroughputscreening,HTS)是使用机器人和自动化系统,从大量的样本中鉴别出对确定的分子靶标有相互作用的少量活性化合物的一种技术。
被筛选出来的化合物可作为先导化合物,进一步研究开发成为新一代安全、有效的新型药物。
药物高通量筛选分析技术是在长期药物研究经验的积累和科学技术的进步,如分子生物学、分子病理学、分子药理学、微电子技术等学科发展的基础上,形成的发现药物的新方法,每天可以对数千至数万样品的药物活性进行检测分析。
分析对象除药理活性外,还涉及药代动力学性质、不良反应等。
相当多的高通量筛选分析方法是以微孔板(如96孔板)为基础的,加上高度自动化的操作设备(细胞采集设备、样品转移、冲洗、孵育、离心等设备、信号检测及数据处理设备等)。
具体方法因检测对象不同而不同,但都是建立在对检测对象分子或细胞水平的生物学机制有一定把握的基础之上。
所使用的技术包括基于放射性的检测技术,基于荧光、发光或比色的检测技术,以及ELISA、报告基因、双杂交技术等自动化技术,不经过滤分离直接测定信号的“同质”技术,闪烁亲近测定法(scintillationproximityassay,SPA),以及报告基因技术等,是实现高通量筛选分析的重要手段之一。
(一) 高通量药物筛选的自动操作系统
高通量药物筛选每天要对数千化合物样品进行检测,工作枯燥、步骤单一,人工操作容易疲劳、出错。
自动化操作系统采用微孔板作为反应容器,具有固定的阵列(format);
不同的微孔板通过条形码加以标记。
自动化操作系统通过光电阅读器对特定的微孔板上的特定位置进行操作,并将操作结果及相关数据存贮在计算机内,使筛选结果准确,实验过程快速。
自动化操作系统利用计算机通过操作软件控制整个实验过程。
操作软件采用实物图像代表实验用具,简洁明了的图示代表机器的动作。
编程过程简洁明了,可操作性强。
自动化操作系统的工作能力取决于系统的组成部分,根据需要可配置加样、冲洗、温孵、离心等设备以进行相应的工作。
除了实验步骤的需要以外,自动化的加样方式是决定筛选速度的重要因素。
目前主要有单孔、8孔、96孔、384孔等几种方式。
单孔一般用于对照样品以及复筛中零散样品的转移。
96孔、384孔在酶活性检测以及需同时开始、同时终止反应的筛选模型中是必需的。
自动化操作系统的一个重要组成部分是堆栈(hotel)。
所谓堆栈是指在操作过程中用来放置样品板、反应板以及对它们进行转移所需的腾挪空间。
因此,高通量筛选的样品数量取决于堆栈的容量。
由此可见,高通量药物筛选的自动化操作系统由计算机及其操作软件、自动化加样设备、温孵离心等设备、堆栈4个部分组成。
研究者可根据主要筛选模型类型、筛选规模选购不同的部分整合成为一个完整的操作系统。
(二)高通量药物筛选的检测系统
快速、高灵敏度的检测技术是高通量药物筛选的关键技术之一。
在高通量药物筛选中,检测系统一般采用液闪计数器、化学发光检测计数器、宽谱带分光光度仪、荧光光度仪等。
检测仪器灵敏度的不断提高,即使对微量样品的检测,也可以得到很好的检测效果。
1.液闪计数 放射性同位素广泛用于受体结合测定、细胞毒性、细胞增殖实验、药物代谢示踪以及基因分析中。
由于采用了双光电倍增管及时间分辨偶合回路(timeresolvedcoincidencecircuit)技术,有效地降低了背景信号的干扰,使测定灵敏度提高,同位素用量少。
在96孔板的分析检测中,背景信号可控制在10cpm左右。
闪烁亲近测定法(SPA)是一种新的液闪分析法。
该方法通过亲和结合,将放射配基结合到具有受体的闪烁球上,从而产生光子,减少了放射配体标记分析中的游离配基与结合配基的分离过程,使得放射配基分析可以以全自动化的方式进行,在更大程度上适应于高通量药物筛选。
2.分光光度术 为了适应高通量药物筛选,许多公司都生产了具备计算机接口并能对多孔板进行同时检测的分光光度计。
以MolecularDevice公司的spectra190为例,它采用8条光导纤维同时对8孔进行测定。
测定波长以2nm为间隔,可以在190nm~850nm间进行选择。
对未知物质,可在该范围内进行扫描以确定其特征吸收光谱。
因此,大大增加了建立模型的多样性。
检测数据以不同文件格式输出,可用随机软件或通用数据处理软件进行处理。
方便、快速、准确、自动化程度高。
分光光度术高灵敏仪器同自动化操作系统的连接,使得基于紫外、可见光谱的高通量药物筛选模型成为主要模型种类。
3.化学发光检测 化学发光指生色物质在酶促作用下,化学能以光子的形式释放出来。
化学发光根据发光的形式和种类分为辉光型和闪光型发光两种。
辉光型化学发光如以AMPPD、CDPS、ECL、Diagoxigein等为基础的发光反应。
其发光时间较长且稳定。
而以发光蛋白、ATP、荧光素酶等为底物的发光反应则是闪光型发光反应,其发光时间较短。
由于时间分辨及偶合回路技术的使用,对于背景的去除更为有效,使得化学发光的检测灵敏度达到0.1pg数量级。
在单孔多点喷射技术中,用于检测化学发光的光导纤维末端带有一喷头,用来加入反应性底物。
反应性底物从100个小孔喷出,使反应性底物加入孔中后即可均匀混合。
发光反应同时启动后,可立即进行测定,对于闪光性化学发光的测定更为有利。
4.激发荧光检测 新型激发荧光检测仪在传统仪器的基础上,用连续的激发光谱和测定光谱取代固定光谱。
使模型的建立更具备灵活性。
96孔板和384孔板的信号采集和处理模式使之适用于高通量药物筛选中。
(三)高通量药物筛选的数据库管理系统
高通量药物筛选的特点是对数以万计的化合物样品进行多模型的筛选。
与高通量药物筛选相适应的数据库管理系统主要承担4个方面的功能。
(1)样品库的管理功能:
化合物样品库对进行高通量药物筛选的化合物样品的各种理化性质进行存储管理。
对每一个新入库的化合物进行新颖性分析,排除结构雷同的化合物,避免不必要的筛选。
由于高度反应性基团增加了假阳性出现的几率,样品库对新入库的化合物进行反应基团检测以去除这类化合物。
(2)生物活性信息的管理功能:
:
生物活性库存贮每一化合物经过不同模型检测后的结果,并根据多个模型的检测结果对化合物的生物活性进行综合评价。
(3)对高通量药物筛选的服务功能:
高通量药物筛选的工作量大,自动化程度高,也涉及到许多繁琐的工作。
高通量药物筛选数据库管理系统对与药物筛选相关的业务往来通讯、档案管理以及各种样品标签的打印进行管理,使高通量药物筛选的各个环节程序化、标准化。
(4)药物设计与药物发现功能:
高通量药物筛选产生大量的化合物结构信息,随着筛选的进行,生物活性信息也将大幅度提高。
高通量药物筛选数据库管理系统通过对同一模型不同的呈现阳性反应的化合物结构进行分析,找出其构效关系,从而为药物设计提供参考。
(四)高通量药物筛选的基本过程
高通量药物筛选结果虽然多数情况下能够提供样品化合物作用机制的信息,但并不能完全证明它对某种疾病具有防治作用。
因此,采用高通量药物筛选方法来发现药物一般采取以下几个步骤。
1.初筛和复筛 药物的初筛和复筛就是在分子、细胞水平上筛选样品,证明某一样品对该靶点具有药理活性(或亲和力)。
初筛以后,选择具有活性的化合物,采用系列浓度,进行同一模型的复筛,阐明其对该靶点的作用特点、作用强度和量效关系,由此发现活性化合物(样品)。
2.深入筛选 深入筛选是在初筛和复筛的基础上,将得到的活性化合物在与初筛不同但相关的分子、细胞模型作进一步的筛选。
其筛选内容包括:
活性化合物的选择性、细胞毒性以及其它性质。
经过深入筛选,可为比较全面地评价活性化合物的药用价值提供更充分的实验资料。
根据这些资料并结合活性化合物的化学结构特点,进行综合分析,确定在结构和作用方面具有新颖性和开发价值的化合物(样品)作为先导化合物。
同时,也可以结合组织器官或整体动物模型,证明其药理作用,为活性化合物提供更加充分的实验依据。
获得先导化合物以后,根据实际情况进行结构优化(根据资料也可以直接作为药物候选化合物进行开发),即进行化合物结构的改造,以便得到活性更高、缺点更少的活性物质。
普通的结构优化手段是经过分子设计进行多种衍生物的合成。
近年发展起来的组合化学技术为结构优化提供了强有力的手段。
结构优化后的化合物需要重复筛选过程,以得到高效的新化合物。
3.确证筛选 确证筛选(confirmatoryscreening)是对深入筛选获得的先导化合物或优化后的被选定的活性最好的化合物进行更深入广泛的研究。
其内容包括药理作用、药物代谢过程、一般毒性等多方面的筛选,以确定其开发前景。
对符合药物要求的样品,确定为“药物候选化合物(candidatecompounds)”,进入开发研究程序,即临床前研究,为临床研究准备必要的资料。
以上过程是对筛选靶点明确的筛选模型而言,在实际工作中,可以采取多种灵活的方式和方法,最终目的是为了高效地发现新药。
综上所述,高通量筛选方法作为新药发现的手段具有明显的优势,它具有选择范围广、筛选成本较低、结果可靠等特点,是新药研究的重要技术。
四、基因芯片技术
生物芯片(BioChip)是用微加工技术(光刻、光化学合成、激光立体化刻蚀等)并结合分子生物学技术制成的具有一定生物学分析检测功能的微型器件。
可用于完成生物样品的分离、制备、生化反应及产物的检测等一系列过程。
基因芯片(GeneChip),又称DNA芯片(DNAChip),是最重要的一种生物芯片。
基因芯片上集成了成千上万的网络状密集排列的基因探针,能够在同一时间内分析大量的基因,迅速读取与生命相关的基因信息。
它是受到在固相支持物上合成多肽的启发而发明的。
美国Affymetrix公司总裁Fodor为主要的发明者之一。
随着DNA芯片技术不断完善,已经在基因诊断、基因表达、基因组研究、发现新基因及各种病原体的诊断等生物医学领域中显示出应用价值。
基因芯片的研究和应用可以大大推进人类基因组计划和蛋白质组科学的研究。
通过比较不同个体或物种之间以及同一个体在不同生长发育阶段,正常和疾病状态下基因表达的差异,寻找和发现新的基因,研究基因的功能以及生物体在进化、发育、遗传等过程中的规律。
基因芯片可为探索不同层次多基因协同作用的生命过程提供手段,将在研究人类重大疾病如癌症、心血管病等相关基因及作用机理方面发挥巨大的作用。
一些著名的医药公司已将基因芯片技术用于新药筛选。
以期从天然产物和合成物中筛选基因相关药物。
(一)基因芯片用于药靶的研究
据推测,人类约有3万种疾病,许多疾病由遗传因素引起。
一些慢性疾病如高血压、Ⅱ型糖尿病等为多种基因相关疾病,每种这类疾病可能涉及5~10个基因。
这些疾病相关基因都有可能成为药靶(药物作用靶点)。
每一基因产物及与其发生作用的蛋白质也有可能成为药靶。
利用基因芯片可以比较正常组织(细胞)及病变组织(
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