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如果反应曲线良好或已经优化好反应体系,也可以不加ROXTM染料校正。
通常来讲,real-timeqPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样,要变性、退火、延伸3步。
由于其产物长度在80-150bp之间,所以只需要变性和退火就可以了。
SYBR@Green等染料法,最好在PCR扩增程序结束后,加一个溶解程序,来形成溶解曲线,判断PCR产物的特异性扩增。
而溶解程序,仪器都有默认设置,或稍有不同,但都是一个在产物进行溶解时候,进行荧光信号的收集。
3.仪器设置
所有仪器的操作都基本一致。
设置的时候包括反应板设置(platesetup)和程序设置(programsetup)。
我们以ABIStepOne为例,详细看一下反应设置:
A.首先是实验目的选择:
定量还是其他。
我们命名为“BioTeke”,进行“定量”实验。
B.实验方法的选择:
我们选用的比较Ct的SYBRGreen方法,Fast程序,以cDNA为模板进行。
C.目的基因的设置:
有几个目的基因和目的基因的名称。
D.样品的设置:
包括哪个是实验组,哪个是对照组。
以及负对照的设置和生物重复的设置。
E.对照组和内参基因的设置:
这个是为后面的定量做准备
F.反应程序的设置:
PCR反应程序的设置要根据不同公司的MasterMix。
比如BioTeke的95℃2分钟就可以激活DNA聚合酶(ABI的需要10分钟)。
循环反应是95℃15秒,60℃15秒的40个循环。
溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以。
或者是仪器说明书上建议的程序。
G.反应体系的设置:
A-G这五个步骤简单设置好,可以保存,修改反应程序或者立刻进行反应。
需要注意一点ABI仪器需要加ROX参比染料,默认的是ROX。
有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面;
也有的是单独分开。
要根据不同公司的MasterMix进行这一个步骤的选择。
BioTeke的MasterMix里没有参比染料,所以选择“none”。
设置好之后,就可以把配置好的PCR管放进仪器,点击RUN!
五、Real-timeqPCR数据分析
常见参数
基线(baseline)
通常是3-15个循环的荧光信号
同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线
阈值(threshold)
自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍
手动设置:
置于指数扩增期,刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。
同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值,但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。
Ct值:
与起始浓度的对数成线性关系。
分析定量时候一般取Ct:
15-35。
太大或者太小都会导致定量的不准确。
Rn(Normalizedreporter)是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。
△Rn:
△Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果(△Rn=Rn-基线)。
2.影响Ct值的关键因素
模板浓度
模板浓度是决定Ct的最主要因素。
控制在一个合适范围内,使Ct在15-35之间。
反应液成分的影响
任何分子的荧光发射都受环境因素影响----比如溶液的pH值和盐浓度。
PCR反应的效率
PCR反应的效率也会影响Ct值。
在PCR扩增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增,与PCR扩增效率高的条件下相比,可能会所产生斜率不同的标准曲线。
PCR效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量。
一般说来,反应效率在90-110%之间都是可以接受的。
3.如何评估实时定量PCR反应的效果
PCR扩增效率:
为了正确地评估PCR扩增效率,至少需要做3次平行重复,至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度。
常见问题
1.无Ct值出现
检测荧光信号的步骤有误:
一般SG法采用72℃延伸时采集,Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
引物或探针降解:
可通过PAGE电泳检测其完整性。
模板量不足:
对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
模板降解:
避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
值出现过晚(Ct>
38)
扩增效率低:
反应条件不够优化。
设计更好的引物或探针;
改用三步法进行反应;
适当降低退火温度;
增加镁离子浓度等。
PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
PCR产物太长:
一般采用80-150bp的产物长度。
3.标准曲线线性关系不佳
加样存在误差:
使得标准品不呈梯度。
标准品出现降解:
应避免标准品反复冻融,或重新制备并稀释标准品。
引物或探针不佳:
重新设计更好的引物和探针。
模板中存在抑制物,或模板浓度过高
4.负对照有信号
引物设计不够优化:
应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
引物浓度不佳:
适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比。
镁离子浓度过高:
适当降低镁离子浓度,或选择更合适的mix试剂盒。
模板有基因组的污染:
RNA提取过程中避免基因组DNA的引入,或通过引物设计避免非特异扩增。
5.溶解曲线不止一个主峰
6.扩增效率低
反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。
反应条件不够优化:
可适当降低退火温度或改为三步扩增法。
反应体系中有PCR反应抑制物:
一般是加入模板时所引入,应先把模板适度稀释,再加入反应体系中,减少抑制物的影响。
7.同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线,如何判断
判断标准:
扩增效率,灵敏度,特异性
如果扩增效率在90%-110%,都是特异性扩增,都可以把数据用于分析。
8.扩增曲线的异常比如“S”型曲线
参比染料设定不正确(MasterMix不加参比染料时,选NONE)
模板的浓度太高或者降解
荧光染料的降解
荧光定量PCR问题汇总
1.定量PCR仪的开关机顺序是怎样的
按照正确的开关机顺序操作,有助于延长仪器的使用寿命,减少仪器出故障的频率。
开机顺序:
先开电脑,待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机,等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件,进行实验。
关机顺序:
确认实验已经结束后,首先关闭信号收集软件,然后关掉定量PCR仪主机的电源,最后关闭电脑。
2.哪些种类的反应管和盖子适合定量PCR实验使用有何需要注意的地方
定量PCR实验可以使用以下耗材:
96孔光学反应板配合光学膜,光学八联反应管配合光学膜,光学八联反应管配合平盖的光学八联管盖。
ABI公司生产的定量PCR耗材的具体使用方法和货号见下表:
3.为什么要定期对电脑进行磁盘碎片整理怎样整理
当运行实时定量PCR仪及使用软件分析实验结果时,计算机会删除并创建若干文件,计算机硬盘的空闲空间会被分割成越来越多的小块。
当硬盘驱动器上文件以分解的碎片存储时,程序需要更长的时间才能存取文件,因为必须多次寻找文件碎片以存取不同的片断。
碎片整理实用程序将一个文件分解开的多个碎片合并在一起,并存储到硬盘的同一个位置,从而清除文件碎片,进而优化系统性能。
碎片整理的方法如下:
·
在Windows桌面上,选择开始(start),我的电脑(Mycomputer)。
在(我的电脑)窗口中,用鼠标右键单击硬盘驱动器,并选择(属性)property。
在(属性)对话框中选择工具(Tools)选项卡,单击开始整理(Defragmentnow)。
单击碎片整理(Defragment)。
当显示“碎片整理完毕”对话框时,单击(确定)。
在“本地磁盘属性”对话框中,单击(确定)。
为计算机机中剩余的驱动器重复如上步骤。
4.何时执行windowsservicepack更新
不要执行该操作。
除非美国应用生物系统公司代表通知您更新操作系统,否则请不要更新控制定量PCR仪的计算机的操作系统。
新版本的MicrosoftWindows操作系统有可能与SDS软件存在冲突,并导致仪器不能正常运行。
如果您希望安装servicepack(更新包)以更新操作系统,应查看随SDS软件提供的版本说明,避免兼容性问题。
5.应该备份哪些数据
应该定期备份您的实验数据,备份频率推荐每周一次,用光盘刻录。
同时您也应该备份定量PCR仪的各种纯荧光光谱校正文件、背景文件和安装验证实验数据,这些文件所在的目录是C:
/Appliedbiosystems/SDSDocument。
下图是校正文件的样本。
6.怎么样的实验室环境才能保证仪器设备正常运行
良好的实验室环境有助于延长仪器的使用寿命,减少仪器出故障的频率。
推荐做到以下几个方面:
电源:
推荐配备合适的UPS或稳压器。
通风:
仪器的通风应该没有阻挡。
温度:
推荐实验室配备空调,温度应该控制在10-30°
C之间。
湿度:
20-80%;
对于潮湿的省份,推荐实验室配备除湿机。
空间:
易于操作,安全。
7.怎样判断定量pcr仪的样本加热块是否被污染怎样清除污染
一个办法是运行背景校正反应板,当一个或多个反应孔连续显示出不正常的高信号,则表明该孔可能被荧光污染物。
另外一种办法是在不放任何物品到样本块上的前提下,执行ROI的校正,当某个孔的信号明显高出其他孔时,则表明该孔被污染。
清除样本加热块污染的步骤如下:
用移液器吸取少量乙醇并滴入每个污染的反应孔中。
吹打数次。
将废液吸入废液杯中。
重复以上步骤:
乙醇三次,去离子水三次。
确认反应孔中的残留液体蒸发完。
8.什么是背景校正多长时间执行一次背景校正
背景校正程序测量定量PCR仪所使用的反应管和水的空白荧光强度。
在运行校正程序期间,定量PCR仪在10分钟内连续读取背景校正板的荧光强度,信号收集的温度为60°
C。
随后,SDS软件计算所收集到的荧光强度的平均值,提取结果并保存到校正文件中。
软件在今后的分析中将自动调用此校正文件,从实验数据中扣除背景信号。
因为背景荧光的信号强度随着许多外界因素(比如外来的污染、反应板/反应管的生产厂商不同、水的纯度等)而变化,所以推荐定期进行背景校正,一般每三个月到半年校正一次。
9.什么是纯荧光校正多长时间校正一次
纯荧光校正是测定各种纯荧光染料标准品的波长和信号强度,通俗地说是让仪器“认识”各种荧光染料。
软件收集并储存各种纯荧光染料标准品的荧光信息。
以后每次定量实验运行过程中,SDS软件收集样品的原始光谱信号,并将此原始光谱与纯荧光文件中的数据进行比较,精确扣除不同染料的信号重叠部分,从而确定样品中的荧光染料种类和信号强度。
推荐每半年进行一次纯荧光校正。
在运行光谱校正之前,请先进行背景校正和ROI校正。
孔板怎样封膜
当使用96孔板做实验的时候,推荐使用光学膜代替盖子来密封反应孔。
正确的封膜方法是:
先沿着96孔板的纵向压膜,然
...
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