血细胞测试方法Word文档下载推荐.docx
- 文档编号:20697484
- 上传时间:2023-01-25
- 格式:DOCX
- 页数:6
- 大小:22.13KB
血细胞测试方法Word文档下载推荐.docx
《血细胞测试方法Word文档下载推荐.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《血细胞测试方法Word文档下载推荐.docx(6页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
具体操作:
一.准备工作:
取一瓶传代的细胞,按照《传代细胞培养(消化法)》中的传代方法繁殖细胞,待长成单层后以被使用。
二.细胞悬液制备:
细胞悬液的制备方法是用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后,加入培养液(或Hanks液或PBS等平衡盐溶液),吹打制成待测细胞悬液。
1.盖好盖玻片:
取一套血球计数板,将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。
2.制备计数用的细胞悬液:
用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中,加入5滴台盼蓝染液(0.4%)或苯胺黑,活细胞不会被染色,加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。
3.将细胞悬液滴入计数板:
将待测细胞悬液吹均匀,然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入,要保证盖片下充满悬液,注意盖片下不要有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中。
4.统计四个大格的细胞数:
将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察,并移动计数板,当看到镜中出现计数方格后,数出四角的四个大铬(每个大格含有16个中铬)中没有被染液染上色的细胞数目。
5.计算原细胞悬液的细胞数:
按照下面公式计算细胞密度:
(细胞悬液的细胞数)/ml=(四个大格子细胞数/4)×
2×
104
说明:
公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。
公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1:
1稀释。
公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为:
1.0mm(长)×
1.0mm(宽)×
0.1mm(高)=0.1mm3而1ml=1000mm3
四.细胞计数要点:
1.进行细胞计数时,要求悬液中细胞数目不低于104个/ml,如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中;
2.要求细胞悬液中的细胞分散良好,否则影响计数准确性。
3.取样计数前,应充分混匀细胞悬液,尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀,以求计数准确;
4.数细胞的原则是只数完整的细胞,若细胞聚集成团时,只按照一个细胞计算。
如果细胞压在格线上时,则只计上线,不计下线,只计右线,不计左线。
5.操作时,注意盖片下不能有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中,否则要重新计数。
五.易犯的错误:
1.计数前未将待测悬液吹打均匀。
2.滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。
3.滴入悬液时的量太多,至使细胞悬液流入旁边的槽中。
六.本实验特殊试剂的配制:
4%台盼蓝母液:
称取4克台盼蓝,加入少量蒸馏水研磨,加双蒸水至100毫升,用滤纸过滤,4℃保存。
使用液:
使用时,用PBS稀释母液至0.4%即可。
一、原理
培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好,所以要进行细胞计数。
计数结果以每毫升细胞数表示。
细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。
在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞,总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力,由组织中分离细胞一般也要检查活力,以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。
复苏后的细胞也要检查活力,了解冻存和复苏的效果。
用台盼兰染细胞,死细胞着色,活细胞不着色,从而可以区分死细胞与活细胞。
利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应,也可测定细胞相对数和相对活力。
二、仪器、用品与试剂
1、仪器与用品:
普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、酶标仪(或分光光度计)
2、试剂:
0.4%台盼兰,0.5%四甲基偶氮唑盐(MTT)、酸化异丙醇
3、材料:
细胞悬液
三、操作步骤
(一)细胞计数
1、将血球计数板及盖片用擦试干净,并将盖片盖在计数板上。
2、将细胞悬液吸出少许,滴加在盖片边缘,使悬液充满盖片和计数板之间。
3、静置3分钟。
4、镜下观察,计算计数板四大格细胞总数,压线细胞只计左侧和上方的。
然后按下式计算:
细胞数/ml=4大格细胞总数/4×
10000
注意:
镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团,应按单个细胞计算,若细胞团占10%以上,说明分散不好,需重新制备细胞悬液。
(二)细胞活力
1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中。
2、加入0.5ml0.4%台盼兰染液,染色2一3分钟。
3、吸取少许悬液涂于载玻片上,加上盖片。
4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数,计细胞活力。
死细胞能被台盼兰染上色,镜下可见深兰色的细胞,活细胞不被染色,镜下呈无色透明状。
活力测定可以和细胞计数合起来进行,但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。
(三)MTT法测细胞相对数和相对活力
活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。
其量与细胞数呈正比,也与细胞活力呈正比。
l、细胞悬液以1000rpm离心10分钟,弃上清液。
2、沉淀加入0.5-1mlMTT,吹打成悬液。
3、37℃下保温2小时。
4、加入4—5ml酸化异丙醇(定容)。
打匀。
5、1000rpm离心,取上清液酶标仪或分光光度计570nm比色,酸化异丙醇调零点。
MTT法只能测定细胞相对数和相对活力,不能测定细胞绝对数。
附:
1、0.4%台盼兰染液配制:
台盼兰0.4克加双蒸水至100ml。
2、MTT配制:
MTT0.5克,溶于100ml的磷酸缓冲液或无酚红的基础液中。
4℃下保存。
3、酸化异丙醇配制:
异丙醇中加入HCl使最终达0.04mol/L。
细胞冻存、解冻方法与细胞计数
一、细胞冷冻保存
1.材料:
生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(SigmaD-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4%(w/v)trypanblue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII)
2、冷冻保存方法:
(1)传统方法:
冷存管置于4℃10分钟--->
-20℃30分钟--->
-80℃16~18小时(或隔夜)--->
液氮槽vaporphase长期储存。
-20℃不可超过1小时,以防止胞内冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
(2)程序降温:
利用已设定程序的等速降温机以-1~-3℃/分钟之速度由室温降至(-80℃以下)-120℃,再放在液氮槽vaporphase长期储存。
适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。
3、步骤:
(1)冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基,使细胞处于指数生长期。
(2)配制冷冻保存溶液(使用前配制):
另取一离心管,加入培养基、血清,逐滴加入二甲基亚砜(DMSO)至20%浓度,即制成双倍的冻存液,置于室温下待用。
(3)离心收集培养之细胞,用加血清的培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。
(4)取与细胞悬液等量的冻存液,缓慢逐滴加入细胞悬液,并晃动试管,制成细胞冻存悬液(DMSO最后浓度为5~10%),使细胞浓度为1~5×
106cells/ml,混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1~2ml/vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测。
严密封口后,注明细胞名称、代数、日期。
然后进行冻存。
4、注意事项:
(1)欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态,约为80~90%致密度。
冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
(2)细胞在液氮中可长期冻存无限时间,而不会影响细胞活力;
在-70度可保存数月。
(3)注意冷冻保护剂之品质。
DMSO应为试剂级等级,无菌且无色(以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品,如SigmaD-2650),以5~10ml小体积分装,4℃避光保存,勿作多次解冻。
Glycerol亦应为试剂级等级,以高压蒸汽灭菌后避光保存。
在开启后一年内使用,因长期储存后对细胞会有毒性。
本方法中先制备双倍冻存液,可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。
缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗,可降低细胞受损。
DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化,可换用10%甘油冻存。
(4)冷冻保存之细胞浓度:
①normalhumanfibroblast:
1~3×
106cells/ml
②hybridoma:
106cells/ml,细胞浓度不要太高,某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。
③adherenttumorlines:
5~7×
106,依细胞种类而异。
Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度,而HeLa只需1~3×
④othersuspensions:
5~10×
106cells/ml,humanlymphocyte须至少5×
106cells/ml。
(5)冷冻保护剂浓度为5或10%DMSO,若是不确定细胞之冷冻条件,在做冷冻保存之同时,亦应作一个backupculture,以防止冷冻失败。
(6)冻存可用10%~90%的血清,一般高浓度血清有助于维护细胞活力,此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积(4度时),复苏存活率在80%~90%以上,对原代培养细胞,以90%血清冻存更为有效。
二、冷冻细胞活化
1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻,以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害,导致细胞之死亡。
2、细胞活化后,约需数日,或继代一至二代,其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。
3、材料
37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器
4、步骤:
(1)操作人员应戴防护面罩及手套,防止冷冻管可能爆裂之伤害。
(2)自液氮或干冰容器中取出冷冻管,检查盖子是否旋紧,由于热胀冷缩过程,此时盖子易松掉。
(3)将新鲜培养基置于37℃水槽中回温,回温后喷以70%酒精并擦拭之,移入无菌操作台内。
(4)取出冷冻管,立即放入37℃水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化,以70%酒精擦拭保存管外部,移入无菌操作台内。
(5)取出解冻之细胞悬浮液,缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:
10~1:
15),混合均匀,放入CO2培养箱培养。
取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。
(6)解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol),依细胞种类而异,一般而言,大都不需要立即去除冷冻保护剂。
惟若要立即去除,则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内,离心1000rpm,5分钟,移去上清液,加入新鲜培养基,混合均匀,放入CO2培养箱培养。
(7)若不需立即去除冷冻保存剂,则在解冻培养后隔日更换培养基。
三、细胞计数与存活测试
1、原理:
(1)计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。
(2)血球计数盘一般有二个chambers,每个chamber中细刻9个1mm2大正方形,其中4个角落之正方形再细刻16个小格,深度均为0.1mm。
当chamber上方盖上盖玻片后,每个大正方形之体积为1mm2×
0.1mm=1.0x10-4ml。
使用时,计数每个大正方形内之细胞数目,乘以稀释倍数,再乘以104,即为每ml中之细胞数目。
(3)存活测试之步骤为dyeexclusion,利用染料会渗入死细胞中而呈色,而活细胞因细胞膜完整,染料无法渗入而不会呈色。
一般使用蓝色之trypanblue染料,如果细胞不易吸收trypanblue,则用红色之Erythrosinbluish。
计算细胞活率:
活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×
100%。
计数应在台盼兰染色后数分钟内完成,随时间延长,部分活细胞也开始摄取染料;
因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力,用不含血清的稀释液,可以使染色计数更为准确。
2、材料:
0.4%w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061);
Erythosinbluishstain;
取0.1gramErythrosinbluish(SigmaE-9259)及0.05grampreservativemethylparaben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline;
血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip);
计数器(counter);
低倍倒立显微镜;
粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。
白细胞稀释液(4%乙酸溶液)。
(1)取50μl细胞悬浮液与50μltrypanblue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。
(2)取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入,盖上盖玻片,于100倍倒立显微镜下观察,活细胞不染色,死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosinbluish)。
(3)计数四个大方格之细胞总数,再除4,乘以稀释倍数(至少乘以2,因与trypanblue等体积混合),最后乘以104,即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。
若细胞位于线上,只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。
注:
4大格细胞总数×
稀释倍数×
104/4=细胞数/ml;
每一大格的体积=0.1cm×
0.1cm×
0.01cm=10-4ml
计数板计数时,最适浓度为5~10×
105细胞/ml,此范围外计数误差偏大。
高浓度细胞悬液,可取出部分作稀释或连续稀释后计数。
5、范例:
T75monolayerculture制成10ml细胞悬浮液,取0.1ml溶液与0.1mltrypanblue混合均匀于试管中,取少许混合液加入血球计数盘,计数四大方格内之细胞数目。
活细胞数/方格:
55,62,49,59;
死细胞数/方格:
5,3,4,6;
细胞总数=243
平均细胞数/方格=60.75;
稀释倍数=2;
细胞数/ml:
60.75×
104×
2(稀释倍数)=1.22×
106;
细胞数/flask(10ml):
1.22×
106×
10ml=12.2×
106
存活率:
225/243﹦92.6%
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 血细胞 测试 方法