生物技术交底书模板Word文件下载.docx
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本部分所提供的内容涉及专利申请文件中最重要的部分,越详细越好。
对于发明专利要求保护的主题是一个技术方案,因而在这部分应当阐述本发明要解决的技术问题(即发明目的)是通过什么样的技术方案来实现的,不能只有原理和功能介绍,应当详细描述本发明的各个发明改进点及相应的技术方案。
技术方案应当通过清楚、完整地描述本发明的技术特征(如菌种名称、微生物生物学特性、应用效果试验方法及证明数据等),使本专业技术领域中的普通技术人员不需通过创造性劳动能够实施本发明为准。
对于不同类型的发明,需要采用不同的描述方式来说明其技术方案。
例如:
(Ⅰ)涉及“微生物”发明的要求
应当包含①微生物名称的描述:
对于新菌株的情况,微生物的分类学名称相应为种名+菌株名,种名采用国际标准命名法命名,菌株名由申请人自己命名,例如:
啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Y-1;
②生物保藏情况体现:
对于新的微生物,应当注明“菌株名+保藏单位简称+保藏号”,例如:
啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Y-1,已于1993年9月8日保藏在中国典型培养物保藏中心,其简称为CCTCC,保藏编号为No.M93049;
③微生物的生物学特性的记载:
包括形态学特性、培养特性、生理特性和代谢特性等;
④制造微生物的方法:
描述应当以本领域普通技术人员能够制造为准,通常包括筛选、诱变、DNA重组技术等;
⑤记载一种微生物的应用效果:
必须在说明书中提供试验证据来证实微生物的用途和实用效果。
(Ⅱ)涉及重组DNA技术发明的要求
涉及DNA分子本身的发明
①DNA分子的详细结构(可以是碱基序列表示)、分子类型及来源等;
②制备过程,包括工艺及条件、收集纯化步骤、鉴定方法等;
③功能和用途,证实这种功能和用途的生物学实验。
涉及载体的发明
制备过程,包括起始载体、制备重组的方法步骤、所用酶、处理条件等;
最好描绘构建重组载体的过程的示意图。
涉及多肽本身的发明
对多肽或蛋白质的名称、结构、制备方法和蛋白质的功能进行描述。
涉及转化体及其制备方法的发明
描述导入的基因或重组载体、宿主、导入方法、收集转化体的方法及鉴定方法等。
本发明的目的在于提供一组用于快速鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的特异性引物,及一种用环介导等温基因扩增技术(LAMP技术)快速鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法。
本鉴定方法方便快捷、价格低廉,适于推广应用。
为达到上述目的,本发明所采用的技术方案如下:
本发明根据结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌16S
RNA的特异性设计4条特异性引物,利用环介导等温扩增技术,在60~65℃,等温扩增60~90分钟,根据显色剂显示的颜色来区分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌。
用于快速鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的特异性引物,包括:
内引物1:
5’
TGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGAGTCGATCTGCACACAGCT
3’(SEQ
ID
No.1);
内引物2:
TGCGCGATGGCGAACTCAAGGCACCGTAAACACCGTAG
No.2);
外引物1:
TCATCGCCGATCATCAGG
No.3);
外引物2:
5’CGAGTTTGGTCATCAGCCG3’(SEQ
No.4)。
一种快速鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法,具体包括如下步骤:
(1)模板DNA的提取:
提取待检样品的DNA,所述待检样品是已鉴定为含有分枝杆菌的样品或分离的分枝杆菌;
(2)环介导等温基因扩增反应:
在200µ
l
PCR管配制反应体系:
引物混合液1µ
l,反应液
12.5µ
l,DNA聚合酶0.5~1µ
l,模板DNA
2~5µ
l,用灭菌去离子水补齐到25µ
l,然后加入20µ
l的密封液,将上述反应管于63~65℃反应60~90min;
所述引物混合液含有上述的4条特异性引物(SEQ
No.1~4),其中,内引物1的浓度为4~8
pmol/µ
l、内引物2的浓度为4~8
l、外引物1的浓度为1
l、外引物2的浓度为1
l;
所述反应液含有10mM
dNTP、10×
ThermoPol反应缓冲液、150mM
MgSO4、
5mM
Betaine,四者的体积比为7~9:
5:
2~4:
9~11;
(3)结果判断:
在上述反应管中加入1~2µ
l显色剂SYBR
GREENⅠ,混匀后观察反应液的颜色,若呈现绿色则为结核分枝杆菌,橙色则为非结核分枝杆菌。
所述反应液中,10mM
dNTP:
10×
ThermoPol反应缓冲液:
150mM
MgSO4:
Betaine(体积比)=8:
3:
10。
所述DNA聚合酶为Bst
DNA聚合酶,浓度为8U/µ
l。
4.本发明创造的优点:
针对上述“现有技术的缺陷和不足”并结合技术方案中的各个发明改进点作出具体说明,即以推理方式具体分析各个改进点如何带来这些优点,使得对优点的说明做到有理有据;
通过对发明的分析和理论说明相结合,或实验数据说明,它可以是产率或疗效的提高、能耗、原材料、工序的节省,操作、控制、使用的简便,降低毒副作用,减少环境污染、代谢产物有药用价值、产量高、菌种存活使用时间长等。
本发明方法方便快捷,能在较短的时间内鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌,且不需要昂贵的仪器设备;
灵敏度高,最低可检测出100个菌/ml;
特异性好,本发明根据16S
RNA基因序列设计4对引物,与目的基因的6个区域结合,具有较高的特异性。
本发明对于结核分枝杆菌或非结核分枝杆菌感染的诊断与临床用药具有较高的参考价值,适于推广应用。
5.具体实施方式及附图:
具体实施方式:
(1)微生物:
应给出微生物的获取方式、筛选过程、生物学实验方法、用途和效果的证明方法等;
(2)DNA重组:
源基因的获取方法、重组制备方式、工艺条件、纯化步骤、鉴定方法等。
具体实施方式应与技术方案相一致,并且应当对权利要求书的技术特征给予详细说明,以支持权利要求书(有多种实施方式时,提供多个实施例);
还应给出相关性能、效果表征的数据等。
附图:
基因工程图谱(包括HPLC图谱、实验曲线、基因重组、电泳图谱等),并针对附图进行说明。
实施例
环介导等温基因扩增反应体系的准备:
(1)反应液:
10mM
Betaine,四者的体积比为8:
10;
(2)引物液:
包括4pmol/µ
l内引物1、4pmol/µ
l内引物2、1
l外引物1、1
l外引物2,四条引物分别为:
No.4);
(3)DNA聚合酶:
Bst
(4)显色剂:
荧光染料
1×
SYBR
Green
I。
用上述反应体系按以下方法对结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌进行鉴定。
本实施例的待检样品为已鉴定为分枝杆菌患者的痰液,当然,也可以为已鉴定为分枝杆菌患者的支气管灌洗液及其它样品,或者分离的分枝杆菌。
1、模板DNA提取:
1)将3ml的痰标本置于室温;
2)在痰样标本中加入2倍痰样体积的4%的NaOH;
3)每隔2min涡旋振荡15s,处理15min,然后吸取1ml加入带旋盖的离心管中;
4)12000r/min离心15min,去上清液;
5)加入0.9%的NaCl
1ml,洗涤,12000r/min离心15min,去上清液;
6)加入100µ
l的纯化水;
7)100℃煮20min,然后冰浴10min;
8)离心取上清液转移至另一支离心管中作为模板DNA。
2、环介导等温基因扩增反应:
引物混合物1µ
l,DNA聚合酶1µ
2µ
l的密封液,将上述反应管放入63℃水浴锅内,反应60min后取出反应管。
3、结果判定:
在上述反应管中加入1µ
I,混匀后观察反应液的颜色,若呈现绿色则为结核分枝杆菌,橙色则为非结核分枝杆菌。
本实施例中,PCR管显绿色,表明待检样品所感染的分枝杆菌为结核分枝杆菌。
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