总大肠菌的测定实验作业指导书Word文档下载推荐.docx
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3、测定原理
3.1水中总大肠菌群的测定
多管发酵是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖、产酸产气以及具备革兰氏染色阴性、无芽孢、呈杆状等有关特性,通过三个步骤进行检验,以求得水样中的总大肠菌群数。
多管发酵法是以最可能数简称MPN来表示实验结果的。
实际上它是根据统计学理论,估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。
如果从理论上考虑,并且进行大量的重复检定,可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。
不过只决于那些既显示阳性有显示阴性的稀释度试管重复数目增加,这种差异便会减少,对于细菌含量的估计值,大部分取决于那些即显示阳性又显示阴性的稀释度。
因此在实验设计上,水样检验所要求重复的数目,要根据所要求数据的准确度而定。
4、试剂
4.1乳糖蛋白胨培养液:
蛋白胨10g
牛肉浸膏3g
氯化钠5g
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乳糖5g
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml
蒸馏水100ml
将蛋白胨、酒肉浸膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000ml蒸馏水中,调节pH为7.2~7.4,再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml,充分混匀,分装于含有倒置的小玻璃管的试管中,与高压蒸汽灭菌器中,在115℃灭菌20min,贮存于暗处备用。
4.2三倍乳糖蛋白胨培养液:
与4.1的配置方法相同,将乳糖蛋白胨培养液浓缩3倍配置。
4.3品红亚硫酸钠培养基:
乳糖10g
磷酸氢二钾3.5g
琼脂20~30g
蒸馏水1000ml
无水硫酸钠5g左右
5%碱性品红乙醇溶液20ml
4.3.1贮备培养基:
先将琼脂加至900ml蒸馏水中,加热溶解,然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨,混匀使其溶解,再加以蒸馏水补足至
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1000ml,调整pH为7.2~7.4。
趁热用脱脂棉或多层纱布过滤,在加入乳糖,混匀后定量分装于烧瓶中,置高压蒸汽灭菌器中,在115℃灭菌20min。
贮存于冷暗处备用。
4.3.2平板培养基:
将上述贮备培养基加热融化。
以无菌操作,根据瓶内培养基的容量,用灭菌吸管按1:
50的比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液致于灭菌空试管中;
再按1:
200的比例称取所需要的无水硫酸钠置于另一灭菌空试管内,加灭菌水少许使其溶解,品红乙醇溶液内置深红色褪成淡红色为止。
将此种混合液全部加入已融化的贮备培养基内,并充分混匀。
立即将此种培养基适量倾入已灭菌的空平皿内,待其冷却凝固后,倒置冰箱内备用。
此种已制成的培养基于冰箱内保存不宜超过两周,如培养基已由淡红色变成深红色,则不能再用。
4.4伊红美蓝培养基
磷酸氢二钾2.0g
琼脂20g
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2%伊红水溶液20ml
0.5%美蓝水溶液13ml
4.4.1贮备培养基:
先将琼脂加至900ml蒸馏水中,加热融化,然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨,混匀使之溶解,再以蒸馏水补足至1000ml,调整pH为7.2~7.4。
4.4.2平板培养基的配置:
以无菌操作,根据瓶内培养基的容量,用灭菌吸管吸取一定量已灭菌的2%伊红水溶液及0.5%美蓝水溶液加入已融化的贮备培养基中,并充分混匀。
当混好的培养基冷至45℃,便立即适量倾倒入已灭菌的空平皿内,待其冷却凝固后,倒置与冰箱备用。
5、步骤
5.1生活饮用水
5.1.1初发酵试管:
在两个装有已灭菌的50ml三倍乳糖蛋白胨培养液的大试管或烧瓶中,以无菌操作各加入已充分混匀的水样100ml;
在10支装有已灭菌的5ml三倍乳糖蛋白胨培养液的试管中,以无菌操作加入充分混匀的水样10ml,混匀后置于37℃恒温箱培养
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24h。
5.1.2平板分离:
经初发酵试管培养24h后,发酵试管颜色变为黄色为产酸,小玻璃倒管内有气泡为产气。
将产酸产气及只产酸发酵管,分别用接种环划线接种于品红硫酸钠培养基或伊红美蓝培养基上,置37℃恒温箱内培养18~24,挑选符合下列特征的菌落,取菌落的一小部分进行涂片、革兰氏染色、镜检。
品红亚硫酸钠培养基上的菌落:
紫红色,具有金属光泽的菌落;
深红色,不带或略带金属光泽的菌落;
淡红色,中心色较深的菌落。
伊红美蓝培养基上的菌落:
深紫黑色,具有金属光泽的菌落;
紫黑色,不带或略带金属光泽的菌落;
淡紫红色,中心色较深的菌落。
5.1.3复发酵试验:
上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽胞的杆菌,则挑选该菌落的另一部分接种于普通浓度乳糖蛋白胨培养
液中(内有倒管),每管可接种分离自同一出发酵管(瓶)的最典型菌落1~3个,然后置于37℃恒温箱中培养24h,有产酸产气者,即证实有大肠菌群菌存在。
根据证实有大肠菌群存在的阳性管(瓶)
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数查表5-2-9,报告每升水样中的大肠菌群数。
5.2水源水
5.2.1将水样做1:
10稀释。
5.2.2于各装有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的五个试管中,各加10ml水样;
于各装有10ml蛋白胨培养液的五个试管中,各加1ml水样;
于各装有10ml蛋白胨培养液的五个试管中,各加入1ml1:
10稀释水样。
共计15个管,三个稀释度,将各管充分混匀,置于37℃恒温箱培养24h。
5.2.3平板分离和复发酵试验的检验步骤同5.1的“生活饮用水”检验方法。
5.2.4根据证实总大肠菌群存在的阳性管数查表5—2—10,即求得每100ml水样中存在的总大肠菌群数。
5.3地表水和废水
5.3.1地表水中较清洁的初发酵试验步骤同5.2的饮用水源水方法。
有严重污染的地表水和废水初发酵试验的接种水样应做1:
10,1:
100,1;
1000或更高的稀释,检验步骤同5.2的饮用水源水方法。
5.3.2如果接种的水样量不是10ml,1ml,0.1ml,而是较低或较高的三个浓度的水样量,也可查表求得MPN指数,在经下面的公式换算
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成每100ml的MPN值。
我国目前以1L为报告单位,MPN值在乘10,即为1L水样中的大肠杆菌。
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游离氯和总氯的测定
表5-2-9大肠菌群检数表
(接种水样100ml2份,10ml10份总量300ml)
10ml水量的
阳性管数
100ml水量的阳性瓶数
1
2
1L水样中大肠菌群数
<3
4
11
3
8
18
7
13
27
38
14
24
52
5
30
70
6
22
36
92
43
120
31
51
161
9
60
230
10
40
69
>230
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表5-2-10最可能数(MPN)表
出现阳性份数
100ml水样中细菌数的最可能数
95%置信限值
100ml水样细菌数的最可能数
95%置信限值
下
限
上
ml
1ml
0.1
下限
上限
<2
26
78
<0.5
80
33
93
34
12
23
89
15
110
46
16
63
21
150
17
49
130
270
94
28
220
79
25
190
250
19
140
37
310
180
44
500
35
300
170
57
700
280
90
850
350
1000
240
68
750
540
1400
920
3200
1600
640
5800
67
≥2400
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