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不同核酸提取方法对荧光PCR定量结果有何影响
中国人民解放军第三0二医院王海滨
写在课前的话
荧光定量PCR质量一般有三个要素,分别是试剂、仪器和人员,另外还有标的影响。
对荧光定量PCR的影响因素较多,因此要得出比较准确、稳定性的PCR结果,需要对各个环节进行严格控制。
荧光定量PCR质量的影响因素有哪些?
一、荧光定量PCR质量的三个要素
荧光定量PCR质量一般有三个要素,分别是试剂、仪器和人员。
试剂是由生产厂家专门提供,包括核酸提取与扩增两个部分。
核酸提取是由不同单位的工作人员进行操作,扩增部分是由厂家专门制备好的。
仪器包括三个方面:
温控、光学和软件,不同仪器温控、光学、软件三个部分原理和性能均有一定差异。
不同单位人员的专业知识和管理方式方法不同,对检测结果也有明显的影响。
另外还有标的影响。
荧光定量PCR质量的影响因素有()
窗体顶端
A.试剂
B.仪器和人员
C.内标
D.以上均有
窗体底端
A.试剂
B.仪器和人员
C.标
D.以上均有
正确答案:
D
解析:
荧光定量PCR质量的影响因素有试剂、仪器和人员和标。
试剂包括核酸提取与扩增两个部分,核酸提取是由不同单位的工作人员进行操作,涉及环节较多。
不同仪器温控、光学、软件三个部分原理和性能均有一定差异。
不同单位人员的专业知识和管理方式方法不同,对检测结果也有明显的影响。
不同核酸提取方法对荧光PCR定量结果有何影响?
二、不同核酸提取方法对荧光PCR定量结果的影响
目前临床常用的核酸提取方法有:
一是聚乙二醇法,也称煮沸法;二是层析柱法,也称为提纯法;第三是磁珠法,也称吸附法。
第四是近年出现的血清或血浆的检测标本直接加入方法。
第五是近年罗氏公司引进的COBASTaqMan全自动核酸提取与扩增系统,其提取原理是磁珠法。
(一)聚乙二醇法
1、操作步骤
取100微升配置好的聚乙二醇工作液,需注意目前所用的聚乙二醇一般是20%的聚乙二醇,较黏稠,试剂盒保存温度为-20度,因此在温室要彻底的复溶,溶化呈液状。
加样时吸100微升,因为黏稠,一定要过吸、停顿,然后把吸头外多余的聚乙二醇粘掉,再加到相应的操作管中。
吸和加均注意停顿,加入到操作管里面的含量应该尽量精确至100微升。
由于液体的黏稠,不同的人、不同的操作手法差异特别大。
加好100微升的聚乙二醇后加入100微升待测标本,主要包括血清、血浆或其他液体,二者要彻底混匀。
第二步是13000转离心,一般用角度离心机离心10分钟,弃掉上清液,尽可能少留残余,并保证不把沉淀物吸掉,沉淀物含有核酸成分。
第三步加入碱性裂解液25微升,碱性裂解液往往带有悬浮物,充分混匀。
含有核酸的沉淀物往往比较黏稠,加上碱性裂解液通过振荡混匀常常不会把沉淀物振开,而如果通过吹打混匀,又容易把沉淀物带走一部分。
此操作环节建议操作人员咨询实际生产厂家,因为试剂盒标准品不通过核酸提取,如果这一步标本的核酸丢失过多,而外标标准又无变化,对结果的影响较大,是振荡混匀或者吹打混匀,要求操作人员和厂家达成共识。
最后一步是100度煮沸10分钟,后13000转离心10分钟。
取上清液进行PCR检测。
2、优缺点
优点是操作较快速,可部分去除标本中的PCR干扰物质(胆红素、血脂、离子等)。
缺点是核酸丢失严重。
弃掉的上清液含有大量HBV(50%左右);碱性裂解液核酸裂解不彻底,与混匀程度密切相关(丢失30%左右)。
操作步骤较多,每个环节均存在不同实验室人员和仪器的差异,因此影响因素较多。
(二)层析柱法
1、操作步骤
层析柱方法主要用于RNA的提取,以QIaGen试剂为例做简单的分析。
它分为四个步骤:
第一步是取560微升已配置好的核酸裂解液,与140微升待检的标本(血清、血浆或其他的液体)混匀,室温静置10分钟。
第二步加500微升的无水乙醇混匀,8000转离心1分钟。
第三步是层析柱过滤,将加过乙醇的标本加到层析柱,通过8000转离心1分钟,滤掉多余液体,核酸即可在层析柱上吸附,然后用洗涤液A和B洗脱柱上的盐和蛋白质,13000转高速离心2分钟,将层析柱和层析膜上多余的物质离下去,在层析柱的中间加50微升的洗脱液,室温静置10分钟,让它彻底溶在水中,10000转离心3分钟,洗脱液即可进行PCR扩增。
2、注意事项
第一步核酸裂解液含有异硫氰酸胍或盐酸胍,胍盐是裂解核酸的物质,它在低温时容易结晶、凝集,结晶后如果不能彻底溶化,只是取上清液和带液标本提取核酸,容易出现假阴性。
通常的做法是在56度的环境让核酸裂解液彻底溶化,以肉眼看不到结晶为标准。
另外是在室温静置10分钟,有的试剂盒是在72度放置10分钟。
目前的核酸裂解液对病毒的裂解效果非常强,二者混匀之后,标本中的核酸基本上在1到2分钟均能够彻底裂解,放置的时间延长对病毒裂解效果不再有意义,反而对标本中的RNA起到降解作用。
因此建议不同的实验室应摸索最佳条件。
第三步是过层析柱,滤过后的液体,再进行一次过滤,发现层析柱过滤的东西含有近一半核酸,包括洗涤液A、洗涤液B洗涤下来的液体。
第四步加50微升洗脱液尤为关键,洗脱液一定要加在层析柱的中间,让它把层析膜完全浸泡,如果加在层析柱的壁上,而洗脱液没有和承袭膜上的核酸进行接触,洗脱液不可能完全洗脱。
每一个洗脱液均含有一定量的核酸,并且每次的丢失量几乎在一半左右。
3、优缺点
此方法的优点是可有效的去除标本中的PCR干扰物质,如胆红素、血脂、离子、蛋白、RNA酶等,提取的RNA的稳定性比较好。
缺点是核酸丢失比较严重,过滤丢失有50%左右,洗脱又接近50%。
另外环境因素影响较大,如裂解液必须彻底的复溶,不能存在结晶、凝集,离心、操作、不同的实验室人员和仪器等的差异。
(三)磁珠法
1、操作步骤
磁珠法为新兴的方法。
磁珠可以和磁吸附,因此可以省去离心过程,也有试剂仍采用离心的方法。
以某公司试剂盒的HCV磁珠法为例做介绍:
第一步,取100微升已经配置好、含有磁珠的核酸裂解液,与100微升的待检标本(血清、血浆或者其他的体液),充分混匀,室温静置10分钟,然后8000转离心2分钟,让含有结合核酸的磁珠沉淀,去掉上清液。
第二步,加洗涤液A和洗涤液B,分别用8000转洗涤2分钟,离心2分钟,去掉上清液。
最后一步有两种做法,一种是把PCR反应液直接加在含有磁珠的试管里,把磁珠溶开,然后直接放置于PCR扩增管里;第二种是把磁珠加洗脱液,将磁珠上的核酸洗脱下来,取上清液进行PCR扩增。
2、优缺点
此方法的优点也是可有效去除PCR干扰物质,其缺点为:
磁珠弃上清和洗涤两次去上清,实验发现每次的上清都含有相应的核酸;磁珠对PCR扩增有影响,洗脱的核酸丢失。
如果把磁珠上的核酸洗脱下来,会产生洗脱不彻底的情况,洗脱应尽可能在37度到50度的环境进行,洗脱下来的核酸量较少。
目前罗氏公司新出的MQ磁珠法提取核酸,洗脱时的环境温度为50度。
(四)血清直接法
1、操作步骤
血清直接法是近年新出现的方法,目前市面上已有两种方法。
一种可称为A法:
取5微升的核酸裂解液和5微升的待检标本(待检标本主要是血清、血浆或血细胞和其他体液,尿液或粪便不能用这种方法),二者混匀后直接加入PCR反应液。
第二种方法可称为B法:
取3μl核酸裂解液,与3μl待检标本(血清、血浆),混匀,95℃处理10分钟,直接加入PCR反应液,13000RPM离心1分钟直接进行PCR扩增。
高温处理10分钟可以把标本中的蛋白沉淀、凝固,沉淀核酸吸出。
和A法不同的是它把蛋白做了沉淀凝固,相应的减少了PCR干扰物质。
2、优缺点
此方法最重要的优点是没有核酸的丢失,定量标准。
B法经过高温处理后使蛋白发生了变形,在很大程度上消除了标本中的干扰物质。
缺点是无法消除标本中PCR干扰物质带来的干扰。
A法目前在国已获得SDA批文,通过临床检测也发现对临床常规的大部分标本影响不是很大,但是对病毒核酸比较低的标本影响还是相对较大。
(五)COBASTaqMan全自动核酸提取与扩增系统
最后一个方法是COBASTaqMan全自动核酸提取与扩增系统,为新进入国的方法,为全自动化设计的病毒载量平台,具有sample-in,result-out的特点;部标准品方法定量,保障结果的准确度和精密度;实验进行中即可添加耗材、样本及试剂,软件可显示所有容的进行状态;所有样本,试剂及耗材采用条码自动扫描设计,方便实验记录及追踪;整个试验流程应最大程度避免污染问题。
分两部分,第一部分是核酸提取系统,第二部分是扩增系统。
其特点为核酸提取是全封闭的,一般需要2到3个小时,可以处理24或48个标本,处理完以后直接把加好的PCR扩增管移到扩增仪器里,扩增仪器有两个扩增装置,可以单独运行。
目前主要用于乙肝、丙肝、艾滋病毒的检测。
对乙肝的检测围,敏感性可以达到12个IU每毫升,线性围是54到1.1×18。
目前临床标本病人的血清病毒的含量均超过了108,因此不建议用此方法检测病毒含量超过1.1×108的标本。
对丙肝低限可以达到15个IU,线性围是43到6.9×107。
临床研究发现,目前丙肝病人血清或血浆中HCVRNA的含量基本上都涵盖在此围之,因此丙肝病人不需要做稀释和特殊选择,HIV也是。
综上所述,把握核酸提取的细节,对检测的质量非常重要,因此操作人员的专业素质尤其重要。
三、仪器对荧光PCR检测结果的影响
与荧光定量有关的环境因素,对于仪器包括三个部分,第一个热模块。
热模块的原理不同,会导致温度均一性。
目前PCR仪器的热模块主要包括半导体、空气和压缩机,空气加热相对比较稳定和快速,均一性相对较好。
第二个是光学模块,即荧光的采集、照相部分。
目前大部分仪器是采用CCD照相的原理、PMT逐行扫描和光栅的逐孔,其中PMT逐行扫描的均一性较好,CCD照相的差异相对较明显。
第三个是软件模块,一般的影响因素较小,但是有的软件可以有效捕捉到PCR扩增指数扩增的点和有效的放大倍数,此倍增的处理能够有效的反应扩增量的变化。
因此软件模块对结果分析的简易程度也有一定影响。
不同的仪器的差异或同一个仪器均一性的实验常选择5点平均分布的方法。
如96孔板,开在96孔板的4个角和中间,加上通往复孔的3到4份标本(同一个核酸含量),然后进行PCR扩增,看五个区域的结果是否能够在有效的的质控围之,即为5点平均分布。
通过实验可发现不同的仪器甚至同类型的仪器存在差异。
因此在选择仪器时要考虑究竟是应用于科研还是临床常规检测,用于科研影响不是很大,但临床检验需对仪器间的差异做校准。
图1理想化的扩增曲线
图1为理想化的扩增曲线。
不论标本中的核酸含量高低,都应该在按照相应指数扩增速度向上扩增,温控、光学、软件模块都应该达到同样的标准和理论值,和实体一致。
理论值和实体值要一致,才能达到比较标准的结果。
图2扩增图图3标准曲线
图4中高拷贝的和低拷贝的平行,它的扩增效果和倍增均一致。
图5有线的交叉,即存在孔间和扩增效率的不一致,对定性实验影响不大,但对定量实验会产生一定影响。
图4平行曲线图5交叉曲线
四、标与标定量对荧光定量的影响
(一)实时荧光定量PCR无需标
提出标目的是避免假阳性。
标有两种,一种是监控核酸的提取,另一个是标定量。
实时荧光PCR不需要标。
实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限,实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度,并记录在软件之中,通过对每个样品Ct值的计算,根据标准曲线获得定量结果。
1、Ct值的重现性:
PCR循环在到达Ct值所在的循环数时,刚刚进入真正的指数扩增期(对数期),此时微小误差尚未放大,因此Ct值的重现性极好,即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管扩增,得到的Ct值是恒定的。
2、Ct值与起始模板的线性关系:
由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系,可利用标准曲线对未知样品进行定量测定,因此,实时荧光定量PCR是一种采用外标准与标本同步进行核酸提取的曲线定量方法。
(二)标对实时荧光定量PCR的影响
若在待测样品中加入已知起始拷贝数的标,则PCR反应变为双重PCR,双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争,尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时,这种竞争会表现得更为显著。
但由于待测样品的起始拷贝数是未知的,所以无法加入合适数量的已知模板作为标。
正因如此,定量方法虽然加入标,仍为一种半定量方法。
美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和标法定量的方法学比较,得出的结论是:
标法作为定量或半定量的手段是不可靠的,而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方法。
图6可看到标在高拷贝时比较低。
如果标本含量比较低,标是53,标本里含量是102,标会把标本曲线压的比较低,出现偏差,甚至出现假阴性。
(三)标的失败率
对采用3家公司考核试剂标失败率分析结果显示,3家试剂的标均存在标失败的情况,但各不相同,阳性标本的失败率在3.2%-16.5%,阴性样本的标失败率在4%-7.2%,高于COBAS的失败率(1.7%,1/60)。
掺入标的量大多为5×103左右,采用PEG和直接加入两种方法对2×103的HBV阳性血清进行96孔重复核酸提取,失败率均为0。
(四)标定量的误差(以COBASTaqMan为例)
统计发现阴性对照的标值(HBV定量检测)为29.1±0.4,即如果没有标本中的核酸干扰,这些标进行扩增,它的Ct值是29.1。
随着标本中的核酸含量升高,会发生相应的变化。
当标本中的核酸是12.1-53IU/ML,标值是29.0±0.8,基本上标和阴性对照相似。
此含量的标本不会对标产生明显竞争。
5×103-5×103IU/ML围标本的标值为28.2±1.6,标出现上移。
5×105-1×108IU/M、>1×108IU/MLL,标分别为27.1±2.9和31.4
图6标定量的影响
±5.8,比阴性对照和低拷贝的更为靠前。
另外对于高拷贝标本中的DNA,其标反而出现相反方向偏斜。
因此用COBASTaqMan标定量的方法进行定量,不建议做高拷贝的标本,尽可能是低于106的标本。
标定量存在另一个问题是如果标本中的含量非常低,标本身会对标本中的核酸扩增产生抑制作用,从而降低敏感性。
五、总结
试剂核酸提取、仪器和人员及标结合起来对荧光定量PCR的影响非常大,它的组成部分比较多,因此要得出比较准确、稳定性的PCR结果,要对各个环节进行控制。
如试剂环节,除了厂家生产要标准化之外,核酸提取尽可能减少核酸的丢失,扩增试剂尽可能效率要高。
准入的仪器应该能满足临床的需求。
但如果要收到稳定和敏感性较高的检测结果,对仪器的选择要进行校准和比对。
人员自身的专业知识和实验室的管理都非常重要,要对人员进行培训,人员操作要熟练,专业知识一定要结合实地、仪器的特点,找到其关键的环节,影响因素比较大的部分一定。
PCR实验室工作因为比较精细,管理方面尽可能减少人员的流动等,严防实验室的污染。
标包括标从核酸提取的标,不参加定量,只是控制假阴性、假阳性。
另一个是标定量。
两种标都参与PCR竞争。
个人的观点是尽可能不要通过标对PCR进行质量监控,要通过科学合理的人员培训、有效的实验室的设置、提高试剂检测质量和减少污染,才能得到有效的检测结果。
对荧光定量PCR的影响因素和环节较多,要得出准确、稳定PCR结果,要对试剂核酸提取、仪器、人员、管理及标各个环节进行严格的质量控制。
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