过表达RhoA基因对C3H10T12细胞成脂分化作用的研究Word文档格式.docx
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4.2.3主要溶液配制
(1)细胞完全培养液、0.25%胰蛋白酶如上2.2.6;
成脂诱导液A、成脂诱导液B
配制如上3.2.3。
(2)2%琼脂糖凝胶:
如上2.1.6。
(3)10mmol/LPMSF:
17.4mg溶于10mL的异丙醇中,分装后存放于一20冰箱。
(4)4xstackinggalbuffer(pH=6.8):
称取强s12.1g溶于150mL去离子水,浓盐酸调pH至6.8,定容至200mL。
(5)4xseperatinggalbuffer(pH=8.8):
称取而s36.3g溶于150mL去离子水,浓
盐酸调pH至8.8,定容至200mL。
(6)10%AP.称取过硫酸铵O.1g溶于1mL超纯水中,置于4℃冰箱储存,一周内用完。
(7)40%Arc.Bis-先称取O.5g溶于20mL小烧杯,37。
CT水浴溶解,再将18.75g溶于其中,后定容至50mL,4℃保存。
使用时恢复至室温。
(8)10%SDS:
称取10gSDS于烧杯中,注入80mL去离子水,50℃水浴下溶解,后定容至100mL,室温条件下保存。
(9)20%Tween20:
取20mL于容量瓶中,去离子水定溶至100mL,混匀后存于
4"
C备用。
(10)stripping抗体洗脱液:
100mMO-巯基乙醇697.6此,2%SDS取20mL,62.5mMTris(pH=6.7)取6.25mL,定容至100mL,50℃水溶30min。
(11)5×
电泳缓冲液:
称Tris15.5g,Gly93.85g,SDS5g于干净的烧杯中,溶解后室温保存。
27
过表达RhoA基因对C3H10TI/2细胞成脂分化作用的研究
(12)1×
转膜缓冲液:
称取"
Iris2.42g,Gly14.4g,甲醇150mL后定容至1000mL,
室温保存备用。
(13)TBS溶液:
Iris2.42g,NaCl8.9g于800mL去离子水中,浓HCl调pH=7.5后定容至1000mL。
(14)TBST溶液:
100mL中加入O.1mLTween20混匀后,现配现用。
(15)封闭液:
称取5g脱脂牛奶于100mLTBST中搅拌溶解,现配现用。
4.2.4RT—qPCI/引物
应用PrimerPremier3.0软件,根据Genebank中提供的PPARy、C/EBPa、RhoA和13.actin序列,按照引物设计的基本要求设计所需的PCR引物,引物长度18bp.25bp之间,由上海生工合成部合成。
引物设计如下:
表4-3Q.PCR引物序列
.Tab.4-3Q衄旦cleQ!
i堂巳堕里曼堡鱼!
Q:
里g垦
GenesPrimersbpTm(*C)
4.2.5抗体
表4-4抗体及生产公司
Tab.4-4antibodyandmanufacturingcompany
抗体名称公司货号
28
第四章过表达RhoAGl4V对C3H10TI/2细胞RhoA/ROCKII信号通路的影响
4.3方法
4.3.1实时荧光定量PCR
(1)提取RNA
将六孔板中培养的细胞用诱导液分别诱导0,1,3,5,7d后,弃去诱导液,PBS
‘
冲洗1次,加入lmLTdzol,室温放置5nfin,吹打使其溶解。
将其完全收集到1.5mL离心管中,向其中加入1/5体积的氯仿,盖紧离心管盖子,剧烈震荡30s;
待其充分乳化后(无分相现象),室温静置5win,120009离心15nfin。
将离心管取出,小心吸取上层清液于新的无RNA酶管中(切记不可吸入中间白色蛋白
层),后向其中加入等量的异丙醇,上下颠倒数次混匀,室温静置10man,120009
4。
C离心10win。
离心后可见明显的白色沉淀,小心去除上清,沿管壁缓慢加入
1mL预冷的75%7,醇,轻轻旋转颠倒清洗管壁,4。
C12000g离心5min。
尽量去除乙醇,室温干燥沉淀2.5man后,加入20此无RNA酶水溶解。
(2)RT-PCR(利用反转录试剂盒)
如方法2.2.4。
(3)RT-qPCR
4.3.2WesternBlot
将待处理细胞胰酶消化后,室温1200rpm/min离心3min,预冷PBS清洗,离心3次。
用含PMSF、Cocktail混合物以及PhoStop的RIPA裂解液提取全蛋白,BCA测定试剂盒测定样本浓度。
每个样品取40腭蛋白,根据分子量大小进行8%,10%和12.5%SDS.PAGE电泳,80V1.5h湿转至PVDF膜,5%BSA室温封闭2h后,加入封闭液稀释的抗体,4。
C孵育过夜,TBST漂洗3次,每次10min;
加入二抗(1:
500),室温孵育2h,TBST漂洗3次,每次10min,ECL显色曝光,显影。
(一)蛋白样品提取
29
过表达RhoA基因对C3HIOTI/2细胞成脂分化作用的研究
(1)提前将裂解液置于室温融化,取10mL于洁净离心管中,加入磷酸酶抑制剂PhoStop、蛋白酶抑制剂混合物Cocktail各1片,溶解后根据实验所需量进行分装保存,使用前加入1%体积的PMSF备用。
(2)在样本中加入适量的裂解液,后继续置于冰上静置10min,收集样本。
(3)12000rpm,4"
C,离心10min,离心所得上清即为蛋白质抽提物。
(二)SDS.PAGE
(1)提取的总蛋白在10%SDS聚丙稀酰胺凝胶中电泳,根据分子量大小选用8%、10%、12.5%的分离胶和4%的浓缩胶,各个浓度的聚丙烯酰胺配方如下:
(2)胶凝好后,将电泳板放入槽内,长板在外,短板在内,在槽内注入电泳缓冲
液使其没过胶板。
拔出梳子,去除气泡,准备上样。
(3)上样液制备:
用5xLoadingBuffer蛋白样品混合稀释至1×
,上样前沸水浴中煮5min变性。
(3)上样,标记好上样顺序,电流调至最大,恒压80V2.5h。
表4-5聚丙烯酰胺凝胶配方
垦!
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胶浓度4%8%10%12.5%
(三)转膜
(1)制备冰袋,并将配制好转印缓冲液放入4"
C冰箱内预冷;
根据胶的大小,裁剪与胶等大的PVDF膜,在膜的正面右上角处标记。
(2)将PVDF膜在100%的甲醇溶液中浸润1分钟左右,然后置于转膜缓冲液中。
(3)将转膜夹黑色一面打开,放上海绵垫,并用玻棒将气泡赶出,使其在液面下
保持水平,按照“黑板一海绵垫一滤纸一胶一PVDF膜一滤纸一海绵垫一白板”
的先后顺序铺板;
30
第四章过表达RhoAGl4V对C3H10T1/2细胞RhoA/ROCKII信号通路的影响
(4)“三明治?
’铺好后,将转印夹夹紧,切记不可移动内层,插入转印槽内使夹子的黑面对槽的黑面,加入足够量的转膜缓冲液,将其置于装满冰的泡沫盒中,接通电源,电流调至最大,恒压80V1.5h。
(5)丽春红染色:
将PVDF膜在丽春红染液中染色5分钟,之后用双蒸水彻底漂洗3次,标记出Marker,剪膜。
(四)封闭及抗体孵育
(1)5%脱脂奶粉:
称取59脱脂奶粉溶于TTBS缓冲液。
(2)转印结束后,将膜室温下用5%的脱脂牛奶封闭2小时。
(3)将膜加入TBST稀释的一抗中,40C反应过夜。
(4)一抗孵育结束后,用TBST,室温漂洗,3次,每次10分钟。
(5)加入TBST稀释的二抗中,室温反应2小时;
之后TBST室温漂洗3次,每次10分钟。
(6)提前将ECL化学发光试剂A、B等体积避光混合备用。
(7)PVDF平铺于薄膜手套上,均匀的涂上ECL发光液,室温反应3min。
(8)暗室曝光。
(五)Striping抗体洗脱液洗脱后压内参
(1)曝光后将PVDF膜浸入去离子水中,摇床清洗5minx2。
(2)将PVDF膜置于装有striping剥脱液体的透明袋中封口,置于65。
C水浴30
min。
(3)TBST清洗PVDF膜10minx3。
(4)操作如上述2.9.4、2.9.5。
4.3.3统计分析
数据统计分析采用SPSS22.0,文中所列数据代表了平均值土标准差(mean土SD)。
分析方法主要是独立样本t检验与均值比较;
组间数据比较采用了多重检验和配对样本t检验处理。
当P<
0.05时,差异被认为具有统计学意义上的显著
性。
31
4.4结果。
4.4.1总RNA的提取及样品鉴定根据说明书,采用Trizol法提取不同时间处理各诱导组细胞的总RNA,提
取离心后可见无RNAse的EP管底部有少量白色沉淀,无RNAse的DEPC水溶解后微量紫外分光光度计检测所有RNA的OD260/OD280均在1.8.2.0之间,浓度在50rig/止以00ng/ttL之间,随即抽取5个RNA样品2%琼脂糖凝胶电泳可见28S、18S和5S三条明显的RNA条带,且28S条带亮度约为18S条带亮度的两倍(图4.1)。
23S.
18S
图4.1总RNA电泳图
Fig.4-1TotalRNAelec缸'
ophoresispaRem
4.4.2过表达RhoAl4V对C3H10T1/2细胞成脂相关基因的影响
(1)RhoA基因的表达
20
10
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图4.2成脂诱导分化过程中RhoA基因的表达情况
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0.05;
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0.01
Fig.4-2ChangesofRhoAgeneexpressionincelladipogenicprocess
幸j1<
+P<
0.01;
comparedwithC3H10T1/2group
结果显示(如图4-2所示),随着诱导时间的延长,RhoAGl4V组细胞的表达
32
第四章过表达RhoAGl4V对C3HIOTl/2细胞RhoA/ROCKII信号通路的影响
量不断下调;
且在.0.3d的下降趋势较明显但其的总体表达量始终高于对照组。
(2)C/EBP的基因表达情况
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图4.3成脂分化过程中C/EBPo基因的表达情况
Fig.4-3ChangesofC/EBPageneexpressionincelladipogenicprocess
宰母尸<
compared谢mC3H10T1/2group
结果显示(如图4.3所示),在诱导过程中,对照组C3H10T1/2的C/EBP基因的表达呈现逐渐升高的趋势,在诱导第1天和第5天分别是两个较大的峰,且第五天为诱导期间表达量最高的点;
RhoAGl4V组细胞呈现逐渐降低的趋势,但其在第1天的表达量为诱导期间的最大值,除去第1天,RhoAGl4V组在诱导期间总体表达量均低于对照组。
(1)PPAR基因的表达
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图4-4成脂分化过程中P鼢Rr_基因的表达情况
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P<
O.01
Fig.4-4ChangesofPPAR丫geneexpressionincelladipogenicprocess
幸·
O.01;
结果显示(如图4.4所示),随着诱导时间的延长,PPARy基因在对照组C3H10T1/2的表达呈现先升高后降低的趋势,在诱导第5天达到最大值;
RhoAGl4V组中的表达呈现逐渐降低的趋势;
诱导期间PPAR7基因在对照组中的表达量始终高于RhoAGl4V组。
33
4.4.3过表达Rhohl4V对C3H10T1/2细胞RhoA/RoCK信号通路关键蛋白的影响
(1)RhoA蛋白的表达
Westemblot检测对照组C3H10T1/2与RhoAGl4V细胞在诱导分化过程中RhoA表达的变化。
如图4.5随着诱导时间的延长,对照组与鼬oAGl4V‘两组细胞中RhoA蛋白表达量均呈现先升高后降低的趋势,且两组细胞在成脂诱导的第3d表达量均最高;
但RhoAGl4V在整个诱导分化过程中的表达量始终高于对照组,且在0、l、7d差异显著(P<
0.05)。
^C3H10T1/2组RhoAGl4V组一一
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图4.5WesternBlot检测成脂分化过程中RhoA蛋白的表达情况木P<
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Fig.4-5WesternBlotdetectedChangesofRhoAproteinexpressionincelladipogenicprocess
幸木P<
O.01:
(2)ROCKII蛋白的表达
Westernblot检测对照组C3H10T1/2与RhoAGl4V细胞在诱导分化过程中ROCK表达的变化。
如图4.6,在对照组细胞诱导分化中ROCK蛋白表达量呈现先升高后降低,其中在第3天表达量达到最高;
在RhoAGl4V组细胞诱导分化中ROCK蛋白表达量较稳定,总体呈现上升趋势;
除去第3天,其它诱导时间点RhoAGl4V在整个诱导分化过程中的表达量始终高于对照组,且在0d差异极显著,1、7d差异显著(P<
O.05)。
34
C3H10T1,2组RhoAGl4V组
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图4-6WesternBlot检测成脂分化过程中ROCK蛋白的表达情况
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Fig.4-6WesternBlotdetectedChangesofROCKproteinexpressionincelladipogenicprocess
¨
(3)MYPTl及p-MYPTI蛋白的表达
如图4.7,在对照组C3H10T1/2细胞诱导分化中MYPTl蛋白水平几乎保持不变,P.MYPTl蛋白表达量呈现先升高后降低,其中在第3天表达量达到最高;
而RhoAGl4V组细胞诱导分化中MYPTl及P.MYPTl的蛋白表达量均呈现平稳状态,只在第5天p-MYPTl的表达量有所下降;
综合比较两组细胞,除去第3
天,其它诱导时间点RhoAGl4V的表达量仍高于对照组。
35
AC3H10T1/2组RhoAGl4V组
0dld3d5d7dOdld3d5d7d
113kDa翻,‘。
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图4.7W骼temBlot检测成脂分化过程中MYPT及p-MYPT蛋白的表达情况
Fig.4—7WesternBlotdetectedChangesofMYPTandp-MYPTproteinexpressionincell
adipogenicprocess.·
(4)MLC及p-MLC蛋白的表达
如图4.8,在对照组C3H10T1/2细胞诱导分化中MLC蛋白水平呈现先升高降低再升高的趋势,p-MLC蛋白表达量呈现先升高后降低,其中在第3天表达量达到最高;
而RhoAGl4V组细胞诱导分化中MYPTl及p-MYPTl的蛋白表达量均呈现逐渐升高的趋势;
整个诱导过程中各时间点p-MLC的表达量RhoAGl4V的表达量均高于对照组,且0、1、5、7d差异显著(P<
36
—————————————————————————————————===————一:
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墨粤童塾壅垄坠!
丝14V对C3H10TI/2细胞RhoA/ROCKn信号通路的影响
AC3H10T1,/2组RhoAG14V组
0dld3d5d7d
19kDa
P-MLC
Ⅳ匝C
43kDa
B
_RhoAGl4VC
—一Rh0AGl4V
1。
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图4-8WesternBlot检测成脂分化过程中MLC及p-MLC蛋白的表达情况
Fig.4-8WesternBlotdetectedChangesofMLCandp-MLCproteinexpressionincelladipogenic
process;
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一
(5)PPARy蛋[的表达
WesternBlot检测PPAR7在第O、1、3、5和7d的表达量,发现RhoAGl4V组细胞PPAR7蛋白的表达量始终低于对照组C3HIOTI/2,且呈现先升高后下降的趋势,对照组PPART的表达量逐渐上升,整个诱导过程中各时间点RhoAGl4V组PPAR7的表达量均低于对照组,且3、5、7d差异显著(P<
37
C3H10T1/2组RhoAGl4V组
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渤《濑黛鬻麟}潮翻—■—誓l,赣;
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攀獭隧,麓藜毒PPAR70dld3d
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