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原代细胞培养的技术要点99
骨髓间充质干细胞培养请教100
细胞培养液放入培养箱中很容易变碱的问题101
细胞培养常见问题及解答102
如何选择合适的动物细胞培养基107
细胞培养注意事项113
动植物细胞培养技术总结
动物细胞培养
细胞培养方式大致可分为两种:
一种是群体培养(massculture),将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中,让细胞贴壁生长,汇合(confluence)后形成均匀的单细胞层;
另一种是克隆培养(clonalculture),将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中,各个细胞贴壁后,彼此距离较远,经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落,称为克隆(clone)。
一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。
此外,为了制取细胞产品而设计了转鼓培养法,使用大容量的圆培养瓶,在培养过程中不断地转动,使培养的细胞始终处于悬浮状态之中而不贴壁。
实验室中常用的几种细胞系
细胞系名称细胞类型来源
3T3成纤维细胞小鼠
HeLa宫颈癌上皮细胞人
BHK21成纤维细胞叙利亚仓鼠
PtKl上皮细胞袋鼠
L6成肌细胞大鼠
PCI2嗜铬细胞大鼠
SP2浆细胞小鼠
SP2/0骨髓瘤浆细胞小鼠
CHO卵巢细胞中国地鼠
正常细胞培养的世代数有限,只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。
所谓转化即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有癌性的细胞。
目前世界上许多实验室所广泛传用的HeLa细胞系就是1951年从一位名叫HenriettaLacks的妇女身上取下的宫颈癌细胞培养而成。
此细胞系一直延用至今。
1.原代培养(primaryculture):
从动物机体取出的进行培养的细胞群。
原代培养的细胞生长比较缓慢,而且繁殖一定的代数后(一般10代以内)停止生长,需要从更换培养基。
将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养(Passage)。
2.细胞株(cellstrain):
从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群,能够繁殖50代左右,在培养过程中其特征始终保持。
3.细胞系(cellline):
从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞,在培养条件下可无限繁殖
4.克隆(clone):
亦称无性繁殖系或简称无性系。
对细胞来说,克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。
植物细胞培养
植物细胞培养主要有如下几种技术:
1.组织培养:
诱发产生愈伤组织,如果条件适宜,可培养出再生植株。
用于研究植物的生长发育、分化和遗传变异;
进行无性繁殖;
制取代谢产物。
2.悬浮细胞培养:
在愈伤组织培养技术基础上发展起来的一种培养技术。
适合于进行产业化大规模细胞培养,制取植物代谢产物。
3.原生质体培养:
脱壁后的植物细胞称为原生质体(protoplast),其特点是:
①比较容易摄取外来的遗传物质,如DNA;
②便于进行细胞融合,形成杂交细胞;
③与完整细胞一样具有全能性,仍可产生细胞壁,经诱导分化成完整植株:
4.单倍体培养:
通过花药或花粉培养可获得单倍体植株,经人为加倍后可得到完全纯合的个体。
细胞培养工艺总结
细胞培育手艺1.实行进行前,无菌室及无菌操作台(laminarflow)以紫外灯照射30-60分钟灭菌,以70%ethanol擦拭无菌操作抬面,并开启无菌操作台电扇运转10分钟后,才开端实行操作。
每次操作只处置一株细胞株,且即便培育基一样亦不共享培育基,以防止掉误混杂或细胞间污染。
实行终了后,将实行物品带上班作台,以70%ethanol擦拭无菌操作抬面。
操作距离应让无菌操作台运转10分钟以上后,再进行下一个细胞株之操作。
2.无菌操作任务区域应坚持洁净及宽阔,需要物品,例如试管架、吸管汲取器或吸管盒等可以临时放置,其它实行用品用完即应移出,以利于气流之流畅。
实行用品以70%ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。
实行操作应在抬面之中心无菌区域,勿在边缘之非无菌区域操作。
3.小心取用无菌之实行物品,防止形成污染。
勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口,亦不要在打开之容器正上方操作实行。
容器翻开后,以手夹住瓶盖并握住瓶身,倾斜约45°
角取用,尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
4.任务人员应留意本身之平安,须穿戴实行衣及手套后才进行实行。
关于来自人类或是病毒传染之细胞株应特殊小心操作,并选择恰当品级之无菌操作台(至少ClassII)。
操作进程中,应防止惹起aerosol之发生,小心毒性药品,例如DMSO及TPA等,并防止锋利针头之损伤等。
5.按期检测下列项目:
5.1.CO2钢瓶之CO2压力
5.2.CO2培育箱之CO2浓度、温度、及水盘能否有污染(水盘的水用无菌水,每周改换)。
5.3.无菌操作台内之airflow压力,按期改换紫外线灯管及HEPA过滤膜,预滤网(300小时/预滤网,3000小时/HEPA)。
6.水槽可添加消毒剂(Zephrin1:
750),按期改换水槽的水。
实行用品
1.品种︰
1.1.细胞培育实行用品均为无菌,除了玻璃容器与pasteurpipet外,其它均为塑料无菌成品。
1.2.TC级培育盘外表均有coating高分子物质以让细胞吸附,培育容器品种有Tflask,plates,dishes,rollerbottle等,依实行需求运用。
1.3.plasticsterilepipet:
1ml,2ml,5ml,10ml,25ml
1.4.塑料离心管:
15ml,50ml,均有2种分歧材质,个中polypropylene(PP)为不透明材质,polystyrene(PS)为通明材质,可依实行需求而选择合适材质之离心管。
1.5.glasspastuerpipet:
9inch,用以抽失落抛弃培育液等。
1.6.玻璃血清瓶(PyrexorDuranglassware):
100ml,250ml,500ml,1000ml
2.清洗︰
2.1.新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05NHCl浸泡数小时,洗净后才开端运用。
2.2.用过之玻璃血清瓶,以高压蒸汽灭菌,洗净后辨别用一次与二次去离子水冲刷干净,勿加洁净剂清洗。
3.灭菌︰
3.1.实行用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖,高压蒸汽灭菌121oC,15lb,20分钟,置于oven中烘干。
3.2.实行用玻璃pasteurpipet以干热灭菌170oC,4小时。
3.3.液体或是固体抛弃物可用10%hypochloride溶液(次氯酸,即漂白水)或是蒸汽高压灭菌121oC,15lb,20分钟处置。
培育基
1.液体培育基储存于4oC冰箱,防止光照,实行进行前放在37oC水槽中温热。
2.液体培育基(加血清)寄存期为六个月,时期glutamine能够会分化,若细胞发展欠安,可以再添加过量glutamine。
3.粉末培育基配制(以1升为例):
3.1.细胞培育基凡间须添加10%血清,因而粉末培育基之配制体积为900ml,pH为7.2-7.4。
NaHCO3为别的添加,若将NaHCO3粉末直接参加液体培育基中会形成pH之误差,或部分过碱。
因而粉末培育基及NaHCO3粉末应辨别消融后才夹杂,然后用CO2气体调整pH,而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH),由于氯离子对细胞发展能够有影响,且储存时培育基的pH易发作改动。
3.2.资料:
3.2.1.纯水(milli-Q水或二次至三次蒸馏水,水质量十分主要)
3.2.2.粉末培育基
3.2.3.NaHCO3(SigmaS-4019)
3.2.4.电磁搅拌器
3.2.5.无菌血清瓶
3.2.6.0.1或0.2mm无菌过滤膜
3.2.7.pHmeter
3.2.8.真空帮浦
3.2.9.CO2气体
3.3.步调:
3.3.1.取粉末培育基溶于700mlmilli-Q水中,搅拌使其消融。
3.3.2.称取过量之NaHCO3粉末(数目依培育基品种而异,表一)溶于200mlmilli-Q水中,搅拌使其消融,然后通入CO2气体至饱和,约3-5分钟。
3.3.3.将消融且含饱和CO2之NaHCO3溶液参加消融之液体培育基中夹杂。
混后溶液之pH应为7.2-7.4,除非pH值偏向太大,不然不需用酸碱再调整之。
若为太碱,可再通入CO2气体调整pH。
培育基以真空帮浦经过过滤膜时,pH会升高0.1-0.2。
3.3.4.以0.1或0.2mm无菌过滤膜过滤灭菌,还分装至无菌容器中,标示培育基品种、日期、瓶号等,储存于4oC。
(血清亦可参加培育基中一同过滤)
3.3.5.配制之培育基配制须作发展实验与污染测试。
4.配制培育基之发展测试
4.1.资料:
4.1.1.MDCKcell(ATCCCCL-34或CCRC60004)
4.1.2.6-wellTCplate(or35mmTCdish)
4.1.3.methanol
4.1.4.glacialaceticacid
4.1.5.10%Giemsasolution(GibcoBRL10092-013)
4.2.步调:
4.2.1.以待测试培育基培育MDCKcell,接种MDCK细胞于6-wellplate(或35mmTCdish)中,每个well接种1×
102活细胞,还刁难照组实行。
4.2.2.接种5~7天后,在100倍倒立显微镜作察看细胞群落之发展,待细胞群落大到可以肉眼察看,而群落间不相互接触时即可。
4.2.3.去除培育基,参加1mlCarnoy’s固定液(甲醇:
冰醋酸﹦3:
1),室温下静置10min。
4.2.4.去除固定液,水洗二次。
4.2.5.参加1ml10%Giemsasolution,,室温下静置染色2-3min。
4.2.6.去除染液,水洗二次。
4.2.7.以肉眼计数群落数,并比拟之,若新配制或新批号的培育基对细胞发展不佳,则丢掉之。
抗生素
1.细胞库之细胞培育基不加抗生素
1.1.培育自ATCC引进之细胞株,培育基中不加抗生素。
1.2.培育自其它实行室引进之细胞株,制造tokenfreeze前培育基须添加抗生素,待tokenfreeze经过污染测试后,很多培育时则不加抗生素。
2.寄送活细胞时,须将培育液充溢整个flask时,则须添加抗生素(penicillin100units/ml+streptomycin100ug/ml)。
3.若要检测mycoplasma,则培育基内不成添加gentamicin,因gentamicin会按捺mycoplasma发展。
4.去除细菌污染之抗生素夹杂配方:
penicillin250units/ml,streptomycin250ug/ml,neomycin250ug/ml,bacitracin2.5units/ml,留意夹杂运用后药物毒性会加强。
5.抗生素运用品种与浓度:
任务浓度.贮存温度.杀灭细菌
penicillin100units/ml-20℃G(+)bacteria
streptomycin100ug/ml-20℃G(+)andG(-)bacteria
chlotetracycline50ug/ml-20℃G(+)andG(-)bacteria
gentamicin50ug/ml-20℃G(+)andG(-)bacteria,mycoplasma
amphotericinB2.5ug/ml-20℃yeastandmolds
nystatin50ug/ml-20℃yeastandmolds
fungizone2.5ug/ml-20℃yeastandmolds
血清
1.血清必需储存于–20~-70oC,若寄存于4oC,请勿超越一个月。
假如一次无法用完一瓶,可将40~45ml分装于无菌50ml离心管中,因为血清结冻时体积会添加约10%,必需预留此膨胀体积之空间,不然易发作污染或容器冻裂之景遇。
2.普通厂商供应之血清为无菌,不需再无菌过滤。
若发现血清有很多悬浮物,则可将血清加入培育基内一同过滤,勿直接过滤血清。
3.瓶装(500ml)血清冻结步调(逐渐冻结法):
-20oC或–70oC至4oC冰箱消融一天,至室温下全溶后再分装,普通以50ml无菌离心管可分装40~45ml。
在消融进程中须规矩摇晃平均(小心勿形成气泡),使温度与成分均一,削减沈淀的发作。
勿直接由–20oC直接至37oC冻结,因温度改动太大,轻易形成卵白质凝聚而发作沈淀。
4.heat-inactivation是指56oC,30分钟加热已完全冻结之血清。
加热进程中须规矩摇摆均匀。
此热处置之目标是使血清中之补体成份(complement)去活化。
除非必需,普通不建议作此热处置,由于会形成沈淀物之明显增多,且会影响血清之质量。
补体参加之反响有:
cytolyticactivities,contractionofsmoothmuscle,releaseofhistaminefrommastcellsandplatelets,enhancedphagocytosis,chemotaxisandactivationoflymphocyticandmacrophagecelltype。
5.勿将血清置于37oC太久,若在37oC放置太久,血清会变得混浊,还血清中很多较不不变之成份亦会因而遭到毁坏,而影响血清之质量。
6.血清之沈淀物
6.1.凝絮物:
发作之缘由有很多种,但遍及之缘由是血清中之脂卵白(lipoprotein)变性及冻结后血清中存在之血纤维卵白(fibrin)形成,这些凝絮沈淀物不会影响血清本身之质量。
若欲削减这些凝絮沈淀物,可用离心3000rpm,5min去除,或离心后上清液可以参加培育基中一同过滤。
不建议用过滤步调去除这些凝絮沈淀物,由于会壅塞过滤膜。
6.2.显微镜下察看之“小黑点”:
凡间经由热处置之血清,沈淀物的构成会明显的增多。
有些沈淀物在显微镜下察看像是“小黑点”,常会误以为血清蒙受污染,而将血清放在37oC中欲培育此“微生物“,但在37oC情况下,又会使此沈淀物增多,更会误以为微生物之增殖,但以培育细菌之培育基检测,又没有污染。
一般来说,此小黑点应不会影响细胞之发展,但若疑心此血清之质量,应立刻停用,改换另一批号的血清。
7.血清之发展测试
7.1.资料:
7.1.1.MDCKcell(ATCCCCL-34或CCRC60004)
7.1.2.a-MEM(alphamodifiedminimalessentialmedium,GibcoBRL12000-022)
7.1.3.6-wellTCplate(or35mmTCdish)
7.1.4.methanol
7.1.5.glacialaceticacid
7.1.6.10%Giemsasolution(GibcoBRL10092-013)
7.2.步调:
7.2.1.以a-MEMwith10%FBS(已测试过)培育MDCK细胞于T75flask至80%confluency。
7.2.2.以trypsin-EDTA处置细胞,离心后,参加过量不加血清之a-MEM制成细胞悬浮液,并测细胞浓度。
以不加血清之a-MEM稀释细胞浓度为1×
102活细胞数/ml。
7.2.3.将1ml细胞悬浮液接种入6-wellplate中,并另参加1ml含分歧浓度的血清(20%,10%,4%,2%,1%,0.4%)之a-MEM,使血清最终浓度为10%,5%,2%,1%,0.5%,0.2%。
用已测试过之血清还进行对照组实验。
7.2.4.37oC,5%CO2培育箱培育5-7天,时期不需改换培育基,待细胞群落大到可以肉眼察看,而群落间不相互接触即可。
7.2.5.去除培育基,参加1mlCarnoy’s固定液(甲醇:
7.2.6.去除固定液,水洗二次。
7.2.7.参加1ml10%Giemsasolution,,室温下静置染色2-3min。
7.2.8.去除染液,水洗二次。
7.2.9.以肉眼计数群落数
7.2.10.核算SPE(SerumPlatingEfficiency):
SPE=(no.ofcolonies/well)/100x100%
7.2.11.核算RPE(RelativePlatingEfficiency):
SPE=[totalcoloniesofsixwell(test)/Totalcoloniesofsixwell(control)]x100%
7.3.比拟各浓度血清培育基之RPE,即可得知待测血清对细胞发展的影响。
7.4.订购多量统一批号的优秀血清,置于–70oC保管之
冷冻细胞活化
1.冷冻细胞之活化准则为疾速冻结,以防止冰晶从新结晶而对细胞形成损伤,招致细胞之死亡。
2.细胞活化后,约需数日,或继代一至二代,其细胞发展或特征显示才会恢复正常(例如发生单株抗体或是其它卵白质)。
3.资料
3.137oC恒温水槽
3.2新颖培育基
3.3无菌吸管/离心管/培育瓶
3.4液氮或干冰容器
4.步调:
4.1操作人员应戴防护面罩及手套,避免冷冻管能够爆裂之损伤。
4.2自液氮或干冰容器中掏出冷冻管,反省盖子能否旋紧,因为热胀冷缩进程,此时盖子易松失落。
4.3将新颖培育基置于37°
C水槽中回温,回温后喷以70%酒精并擦拭之,移入无菌操作台内。
4.4掏出冷冻管,立刻放入37°
C水槽中疾速冻结,轻摇冷冻管使其在1分钟内悉数消融,以70%ethanol擦拭保管管外部,移入无菌操作台内。
4.5掏出0.9ml冻结之细胞悬浮液,慢慢参加有培育基之培育容器内(稀释比例为1:
10~1:
15),夹杂平均,放入CO2培育箱培育。
另取0.1ml冻结细胞悬浮液作存活测试。
4.6冻结后能否立刻去除冷冻维护剂(例如DMSO或glycerol),依细胞品种而异,一般来说,大都不需求立刻去除冷冻维护剂。
惟若要立刻去除,则将冻结之细胞悬浮液参加含有5-10ml培育基之离心管内,离心1,000rpm,5分钟,移去上清液,参加新颖培育基,夹杂平均,放入CO2培育箱培育。
4.7若不需立刻去除冷冻保管剂,则在冻结培育后隔日改换培育基。
细胞传代培育
1.细胞发展至高密度时,即须分殖至新的培育瓶中,普通稀释比例为1:
3至1:
6,依细胞品种而异。
2.资料:
2.1.无菌磷酸心理缓冲液(Dulbecco’sphosphate-bufferedsaline,Ca++/Mg++free,D-PBS,GibcoBRL21600-010)
2.2.trypsin-EDTAsolution(0.05%trypsin-0.53mMEDTA-4Na,GibcoBRL25300-062):
以10ml分装于15ml无菌离心管中,保管于–20oC,运用前放在37oC水槽回温。
2.3.新颖培育基
2.4.无菌吸管/离心管/培育瓶
3.步调:
3.1.附着型胞(adherentcell)
3.1.1.吸失落旧培育液。
3.1.2.用D-PBS洗濯细胞一至二次。
3.1.3.参加trypsin-EDTA溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2),37oC效果数分钟,于倒立显微镜下察看,当细胞将要别离而出现圆粒状时,吸失落trypsin-EDTA溶液。
(若不移去trypsin-EDTA,则在trypsin-EDTA效果后,参加过量含血清之新颖培育基终止trypsin效果,离心后再吸失落上清液。
)
3.1.4.轻拍培育瓶使细胞自瓶壁零落,参加过量之新颖培育基,以吸管上下吸放数次以打散细胞团块,混和平均后,依稀释比例转移至新的培育瓶中,以正常培育前提培育。
3.2.悬浮型细胞(suspensioncell)
3.2.1.吸出细胞培育液,放入离心管中,离心1000rpm5分钟。
3.2.2.吸失落上清液,参加过量之新颖培育基,混和平均后,依稀释比例转移至新的培育瓶中,以正常培育前提培育。
3.3.交融瘤(hybridoma)
3.3.1.有些hybridomacell需培育三天以上才会发生抗体,若是改换培育基,则能够会落空抗体。
因而继代培育不需离心后改换培育基,直接添加新颖培育基稀释细胞浓度即可。
若体积太大,可倾斜放置,或分殖至新培育瓶中。
细胞计数与存活测试
1.道理:
1.1.核算细胞数量可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器主动计数。
1.2.血球计数盘普通有二个chambers,每个chamber中细刻9个1mm2大正方形,个中4个角落之正方形再细刻16个小格,深度均为0.1mm。
当chamber上方盖上盖玻片后,每个大正方形之体积为1mm2x0.1m
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