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这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点:
易于生长和控制;
用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵;
有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是,在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工,常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
原核表达一般程序如下:
获得目的基因-准备表达载体-将目的基因插入表达载体中(测序验证)-转化表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析-扩增、纯化、进一步检测。
关键词:
原核表达;
质粒;
感受态细胞;
电泳
前言
目的:
掌握基因诱导原核表达的原理和方法以及PAGE凝胶电泳的方法。
方法:
本实验采用IPTG诱导基因的表达,构建大肠杆菌表达体系。
该方法实验技术简单,费用低,系统比较完备。
E.coLi的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。
I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态。
在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激活蛋白(CAP)结合位点。
由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成Lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因产物的协调表达。
在没有乳糖存在时,Lac操纵子(元)处于阻遏状态。
此时,I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录起动。
当有乳糖存在时,Lac操纵子(元)即可被诱导。
在这个操纵子(元)体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身。
乳糖进入细胞,经β-半乳糖苷酶催化,转变为半乳糖。
后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。
异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的作用与半乳糖相同,是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。
1、材料与方法
1、材料
1.1实验仪器
电子天平:
AR3130,OhausCorp.Pine.Brank,NJ,USA
水平摇床:
WD-9405B,北京六一仪器厂
垂直电泳槽:
DYCZ-24A,上海天能科技
电泳仪:
DYY-8B,北京六一仪器厂
凝胶成像系统:
GELDOCXR,BIO-RAD
高速冷冻离心机:
CR21G,广州天美
超净工作台:
苏州净化设备厂
离心机:
1-14,SIGMA
6个10mL三角瓶,10个培养皿,洗净,包好,灭菌。
1.2实验主要试剂
(1)取200mL三角瓶配制LB固体培养基100mL(胰蛋白胨(Tryptone)10g/L,
酵母提取物(Yeastextract)5g/L,氯化钠(NaCl)5g/L,琼脂15g/L),灭菌。
用于制备氨苄平板。
(2)取200mL三角瓶配制2*YT100mL(胰蛋白胨)6g/L,酵母提取物10g/L,NaCl,5g/L),灭菌,备用。
(3)100mMIPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷):
2.38gIPTG溶于100mLddH2O中,0.22μm滤膜抽滤。
(4)1moL/L,PH8.8Tris-HCl缓冲液,Tris121g溶于蒸馏水,用浓盐酸调至PH8.8。
(5)10%(w/v)SDS
(6)10%(w/v)过硫酸铵溶10%(w/v)SDS液
(7)四甲基乙二胺(TEMED)
(8)电极缓冲液PH8.3:
Tris30.3g,甘氨酸144.2g,SDS10g,溶于蒸馏水并定
容至1000mL,使用时稀释10倍。
(9)4×
样品稀释液:
SDS500mg,巯基乙醇1mL,甘油3mL,溴酚蓝4mg,1moL/L
Tris-HCL(pH6.8),用蒸馏水溶解并定容至10mL,按每份1mL分装,可在4℃存放数周,或在-20℃保存数月。
以此液制备样品时,样品若为液体,则加入与样平等体积的原液混合即可。
(10)固定液:
500mL乙醇,100mL冰醋酸,用蒸馏水定容至1000mL
(11)脱色液:
250mL乙醇,80mL冰醋酸,用蒸馏水定容至1000mL
(12)染色液:
0.29g考马斯亮蓝R-250溶解在250mL脱色液中
(13)分离胶制备:
凝胶浓度
5%
7.5%
10%
12.5%
15%
凝胶贮液mL
5
7.5
10
12.5
15
1moL/LPH8.8Tris-HCLmL
11.2
水mL
13.7
1.2
8.7
3.7
10%SDSmL
0.3
10%过硫酸铵mL
0.1
TEMED(μL)
20
1.3质粒
质粒由科研训练指导教师提供。
1.4分子量标准
核酸电泳分子量标准PUCMix18DNAMaker和蛋白质电泳分子量标准蛋白Maker。
2、方法
2.1质粒的提取
(1)挑取单个转化菌落,接种到3mL2*YT培养基(含100ug/mLAMP)中,37℃,170rpm/min,振荡培养6—8小时。
(2)将3mL培养物分两次吸到1.5mL离心管中,12000rpm/min离心30s,弃上清。
(3)100uL用冰预冷的无菌溶液I(50M/L葡萄糖;
25M/LTris_HcLph8.0;
10M/LEDTApH8.0),重悬沉淀,剧烈振荡。
(4)加入200uL新配制的无菌溶液II(0.2M/LNaoH;
1%SDS),颠倒数次混匀。
(5)加入150uL用冰预冷的无菌溶液III(5MKAC;
1.9M冰乙酸),轻微混匀,冰浴10min。
(6)4℃,12000rpm/min离心10min。
(7)取上清,加入等体积的TRIS饱和酚—氯仿,颠倒数次混匀。
4℃,12000r/min离心10min。
(8)取上清,加入2倍体积预冷的无水乙醇,混合均匀,置-20℃冰箱30min。
(9)4℃,12000r/min离心10min,弃上清。
(10)沉淀用70%的乙醇洗涤,4℃,12000r/min离心10min,弃上清。
(11)将沉淀于室温晒干,加入20uLTE溶解沉淀。
(12)加无DNA酶的RNA酶至终溶度为20ug/mL,消化RNA,保存备用。
2.2原核表达操作步骤
(1)将冻存的感受态DH5a菌液冰浴融解,吸取质粒5uL加入到100uL感受态大肠杆菌细胞中,冰浴30min,然后置于42℃,处理45s,继续冰浴1——2min。
(2)加入500uL2*YT培养液于37℃振摇50min。
(3)5000r/min,离心2min后,吸去部分上清并剩余100uL。
(4)将沉淀重悬于100uL上清并混合均匀后,均匀涂布于LB固体培养基上(含100ug/mLAMP)表面,37℃培养12-16h。
(5)挑取单个转化菌落,接种到3mL2*YT培养基(含100ug/mLAMP)中,37℃,200r/min,振摇培养3-4小时。
(6)当OD值达到0.6时,加入IPTG至终浓度为1mM,继续培养3小时。
(7)吸取1mL菌液至1.5mL离心管中,8000r/min,离心1min。
(8)将沉淀重悬于90uLH20+30uL4*SDS-PAGE凝胶加样缓冲液中,100℃煮沸10min,裂解。
(9)将细菌裂解液离心,8000r/min,离心1min。
吸取上清液10uL,在12%SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上进行凝胶电泳。
电压为70-90V。
(10)电泳完毕后,将凝胶取下,用考马斯亮蓝染色2-3小时,然后用脱色液脱色1-2小时。
(11)将脱好色的凝胶进行凝胶扫描。
二、实验结果
1.重组质粒表达:
菌株诱导表达后,经SDS-PAGE电泳,发现诱导后带有重组质粒的工程菌表达产物中有一相对分子量大小约为25KD左右的新蛋白区带,与目的蛋白大小一致。
12%SDS-PAGE蛋白胶电泳图;
Marker为蛋白质分子量标准;
1为诱导前的重组工程菌菌体;
2为诱导后的重组工程菌菌体,目的蛋白大小为25KD
2.IPTG诱导表达:
123456789
红色方框圈出部分为IPTG诱导表达产物的电泳条带,9泳道加入了有IPTG诱导的质粒,用以确定空质粒不表达基因,且条带较深处位于下方,说明多含小分子蛋白。
8、9泳道均以单一变量原则设置为空白对照,若缺少IPTG的强诱导作用,目标蛋白的产量也会大大减少。
三.讨论
1.重组子转化的筛选结果:
因第一次涂布后出现大量灰白色带菌丝菌落,而一般E.CoLi菌落应呈圆形、边缘整齐且表面光滑的半透明小凸起,由此推测可能是培养基被霉菌污染所致,需重新进行涂布培养,PH达7.4时为最佳。
2.电泳检测结果:
如图,最明亮的条带应该是IPTG诱导目的基因所表达的产物,由于进行阳性重组质粒筛选后BL21携带大量目的基因,在IPTG诱导的情况下Lac强启动子因阻遏蛋白失活而启动转录,位于其下游的得以表达,从图可知该实验较为成功。
另外,杂质蛋白的出现经分析可能与BL21表达内源性蛋白有关,也可能是LB培养基里的蛋白质有少许混入样品所致,但由于目的基因表达量较高,杂质对其影响不大。
若需要更充分证明产物γ-GCS,可在酶切位点后加入6个His标签,进一步通过His特异性抗体做Western杂交验证产物的表达,此方法对目的基因表达量很少时较适用。
四、总结
整个实验到此基本完结,将原核生物基因用IPTG诱导表达产物的全过程分步进行实验,使我们对之有了具体理解和体会。
在实验过程中,我们发现实验技巧不够成熟,很多仪器使用方法要问过老师才知道,在试剂配制的时候千万要认真,不能多也不能少,操作过程要讲求无菌操作。
故今后实验需善始善终,在注意细节的同时则更要养成持之以恒的良好习惯。
参考文献:
1.《猪白血病抑制因子(LIF)的原核表达》,李明堂、王清爽、果洪宇、李洪广、嵇野、冀伟,长春理工大学学报(自然科学版)2008年03期
2.《蛋白基因的表达载体构建及在酵母中的表达》,李克、成军等,军医进修学院学报
3.《核心蛋白在大肠杆菌和毕赤酵母中表达的比较》,张敏睿、朱娟莉、董兆麟等,微生物学通报
4.《现代分子生物学实验技术》,原核细胞中外源基因的表达和初步纯化
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