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3.载体
(1)常用载体——质粒
(2)其他载体:
λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。
深度思考
如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化,则图中依次表示限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序如何?
提示 限制性核酸内切酶能将DNA分子切割为DNA片段,符合图中①;
DNA聚合酶在DNA复制过程中将脱氧核苷酸连接成DNA链,符合图中④;
DNA连接酶能连接不同的DNA片段,符合图中②;
解旋酶能打开DNA双链形成DNA单链,符合图中③。
故正确顺序应为①④②③。
二、基因工程的操作程序
1.
—
2.
—组成
3.
—方法
4.
基因工程中,需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒,便于重组和筛选。
已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—;
限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。
请据图分析:
切割目的基因时宜选择限制酶Ⅰ还是限制酶Ⅱ切割质粒呢?
请说明理由。
提示 由题图及题干信息知,目的基因两侧分别含—GGATCC—序列和-GATC-序列,若使用酶Ⅰ切割,只能切断一侧,不能切断另一侧,若使用酶Ⅱ切割,则可同时切断两侧,从而切出目的基因,同理,质粒中也含两种酶识别位点,且两识别位点均位于标记基因部位。
若使用酶Ⅱ切割质粒,则可同时破坏两个标记基因,使用酶Ⅰ切割则可保留GeneⅠ作标记基因,故切割目的基因应选择酶Ⅱ,切割质粒应选择酶Ⅰ。
考点一 基因工程的原理及工具
[典例引领]
【典例】(2012·
课标,40)根据基因工程的有关知识,回答下列问题。
(1)限制性核酸内切酶切割DNA分子后产生的片段,其末端类型有________和________。
(2)质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下:
AATTC……G
G……CTTAA
为使运载体与目的基因相连,含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外,还可用另一种限制性核酸内切酶切割,该酶必须具有的特点是____________________。
(3)按其来源不同,基因工程中所使用的DNA连接酶有两类,即________DNA连接酶和________DNA连接酶。
(4)反转录作用的模板是________,产物是_______________。
若要在体外获得大量反转录产物,常采用________技术。
(5)基因工程中除质粒外,________和________也可作为运载体。
(6)若用重组质粒转化大肠杆菌,一般情况下,不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞,原因是______________。
解析 此题考查基因工程应用的相关知识。
(1)DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有黏性末端和平末端两种类型。
(2)为使运载体与目的基因相连,应使二者被切割后产生的末端相同,故用另一种限制酶切割产生的末端必须与EcoRⅠ切割产生的末端相同。
(3)根据酶的来源不同,DNA连接酶分为E·
coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。
(4)以RNA为模板,合成DNA的过程称为逆转录,若要体外获得大量DNA分子,可以使用PCR技术。
(5)在基因工程中,通常利用质粒作为运载体,另外噬菌体和动植物病毒也可作为运载体。
(6)大肠杆菌作为受体细胞时,常用Ca2+处理,使之成为能吸收周围环境中DNA分子的感受态细胞。
答案
(1)平末端 黏性末端
(2)切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生的相同 (3)T4 E·
coli (4)mRNA(或RNA) cDNA(或DNA) PCR(聚合酶链式反应) (5)动植物病毒 噬菌体 (6)未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱
1.基因工程的基本原理和理论基础概括(如下图)
2.限制酶选择的注意事项
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶,如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致,以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等,所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构,如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因;
如果所选酶的切点不是一个,则切割重组后可能丢失某些片段,若丢失的片段含复制起点区,则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
易错警示!
基因工程操作基本工具的8个易错点
(1)限制酶是一类酶,而不是一种酶。
(2)限制酶的成分为蛋白质,其作用的发挥需要适宜的理化条件,高温、强酸或强碱均易使之变性失活。
(3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶,目的是产生相同的黏性末端。
(4)将一个基因从DNA分子上切割下来,需要切两处,同时产生4个黏性末端。
(5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同,同一个DNA分子用不同的限制酶切割,产生的黏性末端一般不相同。
(6)限制酶切割位点应位于标记基因之外,不能破坏标记基因,以便进行检测。
(7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。
基因工程中的载体是DNA分子,能将目的基因导入受体细胞内;
膜载体是蛋白质,与细胞膜的通透性有关。
(8)基因工程中有3种工具,但工具酶只有2种。
[跟进题组]
1.下列有关限制性核酸内切酶的叙述中正确的是( )
A.用限制性核酸内切酶切割一个DNA分子中部,获得一个目的基因时,被水解的磷酸二酯键有2个
B.限制性核酸内切酶识别序列越短,则该序列在DNA中出现的几率就越大
C.—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端碱基数不同
D.只有用相同的限制性核酸内切酶处理含目的基因的片段和质粒,才能形成重组质粒
解析 切割一个DNA分子中部,获得一个目的基因时,被水解的磷酸二酯键有4个;
—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端碱基数相同,都为4个碱基;
只要切割出来的黏性末端的碱基序列相同,都可以被DNA连接酶连接。
答案 B
2.限制性核酸内切酶MunⅠ和限制性核酸内切酶EcoRⅠ的识别序列及切割位点分别是—C↓AATTG—和—G↓AATTC—。
如图表示四种质粒和目的基因,其中箭头所指部位为限制性核酸内切酶的识别位点,质粒的阴影部分表示标记基因。
适于作为图示目的基因载体的质粒是( )
解析 由图可知,质粒B上无标记基因,不适合作为载体;
质粒C和D的标记基因上都有限制性核酸内切酶的识别位点。
只有质粒A上既有标记基因,且MunⅠ的切割点不在标记基因上。
答案 A
考点二 基因工程的操作程序
【典例】(2014·
北京四中期中)科学家从某细菌中提取抗盐基因,转入烟草并培育成转基因抗盐烟草。
下图是转基因抗盐烟草的培育过程,含目的基因的DNA和质粒上的箭头表示相关限制酶的酶切位点。
请分析回答下列问题。
(1)①过程获得的抗盐基因可用PCR技术进行扩增,该技术必须用________酶,所需的原料是________。
(2)已知几种限制酶识别序列及其切割位点如表:
限制酶
BamHⅠ
HindⅢ
EcoRⅠ
SmaⅠ
识别序列及切割位点
G↓GATCCCCTAG↑G
A↓AGCTTTTCGA↑A
G↓AATTC
CTTAA↑G
CCC↓GGG
GGG↑CCC
用图中的质粒和目的基因构建重组质粒,不能使用SmaⅠ酶切割,原因是__________。
图中①②过程为防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化,应选用________________酶对外源DNA、质粒进行切割。
(3)图中⑤、⑥依次表示组织培养过程中抗盐烟草细胞的________、________过程。
(4)为确定转基因抗盐烟草是否培育成功,既要用放射性同位素标记的________作探针进行分子杂交检测,又要在个体水平上鉴定,后者具体过程是__________________。
解析 理解转基因技术的步骤、成果是解题的关键。
(1)PCR技术所需的原料是合成DNA的四种脱氧核苷酸。
根据PCR反应原理,每次循环可分为在95℃时进行变性,在55℃时进行复性,在72℃时延伸,该过程需要耐热的DNA聚合酶。
(2)从图中信息可知,SmaⅠ酶的切割位点位于目的基因和M抗生素抗性基因上。
分析抗盐基因的DNA片段,可知该DNA含四种限制酶切点,其中SmaⅠ位于目的基因上,不宜采用。
EcoRⅠ位于目的基因两侧,若用EoRⅠ切割则目的基因会自身环化。
BamHⅠ与HindⅢ位于目的基因两端,且质粒中也有相应的合适的切割位点,因此用BamHⅠ和HindⅢ才能完整地切下该抗盐基因,同时保证目的基因与质粒连接方式的唯一性,防止自身环化。
(3)转基因后的植物细胞,经脱分化产生愈伤组织,经再分化形成根、芽等,进而产生新的植株。
答案
(1)耐热的DNA聚合 四种脱氧核苷酸
(2)SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因 BamHⅠ和HindⅢ (3)脱分化 再分化 (4)抗盐基因(或目的基因) 将培育的烟草幼苗栽培于含有一定盐的土壤中,观察该烟草植株的生长状态
基因工程操作的基本步骤
1.目的基因的获取
目前有两种途径:
一是直接提取目的基因,如从基因文库中获取。
二是人工合成目的基因,常用的方法有化学合成法和反转录法。
2.基因表达载体的构建
(1)基因表达载体的组成
(2)构建过程
3.将目的基因导入受体细胞
细胞类型
常用方法
受体细胞
转化过程
植物细胞
农杆菌转化法
体细胞
将目的基因插入Ti质粒的T—DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA上
动物细胞
显微注射技术
受精卵
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵→获得受精卵→显微注射→早期胚胎培养→胚胎移植→发育成为具有新性状的动物
微生物细胞
Ca2+处理增大细胞壁通透性
原核细胞或酵母菌
用Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收
4.目的基因的检测与鉴定
(2014·
山东文登三模,35)在培育转基因植物的研究中,卡那霉素抗性基因(kan)常作为标记基因,只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。
如图为获得抗虫棉的技术流程。
请据图回答。
(1)基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤:
目的基因的获取、________、
将目的基因导入受体细胞、_________________。
(2)A过程需要的酶有________和________。
(3)要把重组质粒导入土壤农杆菌,首先必须用________处理土壤农杆菌,使土壤农杆菌转变为________态;
然后将________在缓冲液中混合培养完成转化过程。
(4)含有重组质粒的土壤农杆菌侵染离体棉花叶片组织后,将离体棉花叶片组织培养成再生植株要经过[C]________和[E]________。
如要确保再生植株中含有抗虫基因,可在C过程的培养基中加入________。
(5)目的基因能否在棉花植株体内维持和表达其遗传特性的关键是______________。
这需要通过检测才能知道,检测采用的方法是________。
解析
(1)基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤:
目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
(2)基因表达载体构建过程中,需要用同种限制酶切割目的基因和载体,使它们产生相同的黏性末端,再用DNA连接酶把这两个DNA片段连接起来。
(3)农杆菌转化法导入目的基因时,首先必须用Ca2+处理土壤农杆菌,使土壤农杆菌转变为感受态;
然后将重组质粒和感受态细胞在缓冲液中混合培养完成转化过程。
(4)植物组织培养过程的关键步骤是脱分化和再分化。
因为只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长,故若要确保再生植株中含有抗虫基因,可在C过程的培养基中加入卡那霉素。
(5)目的基因能否在棉花植株体内维持和表达其遗传特性的关键是目的基因是否插入受体细胞的DNA分子上,检测采用的方法是DNA分子杂交技术。
答案
(1)基因表达载体的构建 目的基因的检测与鉴定
(2)限制酶 DNA连接酶
(3)Ca2+ 感受 重组质粒和感受态细胞
(4)脱分化 再分化 卡那霉素
(5)目的基因是否插入受体细胞的DNA分子上 DNA分子杂交技术
题组一 全国课标卷高考集锦
1.(2013·
全国高考)下列实践活动包含基因工程技术的是( )
A.水稻F1花药经培养和染色体加倍,获得基因型纯合新品种
B.抗虫小麦与矮秆小麦杂交,通过基因重组获得抗虫矮秆小麦
C.将含抗病基因的重组DNA导入玉米细胞,经组织培养获得抗病植株
D.用射线照射大豆使其基因结构发生改变,获得种子性状发生变异的大豆
解析 A项所述为单倍体育种,B项所述为杂交育种,D项所述为诱变育种,都没有涉及基因工程技术;
C项所述育种方法涉及组织培养技术和基因工程技术。
答案 C
2.(2014·
课标Ⅱ,40)植物甲具有极强的耐旱性,其耐旱性与某个基因有关。
若从该植物中获得该耐旱基因,并将其转移到耐旱性低的植物乙中,有可能提高后者的耐旱性。
回答下列问题:
(1)理论上,基因组文库含有生物的________基因;
而cDNA文库中含有生物的________基因。
(2)若要从植物甲中获得耐旱基因,可首先建立该植物的基因组文库,再从中________出所需的耐旱基因。
(3)将耐旱基因导入农杆菌,并通过农杆菌转化法将其导入植物________的体细胞中,经过一系列的过程得到再生植株。
要确认该耐旱基因是否在再生植株中正确表达,应检测此再生植株中该基因的__________,如果检测结果呈阳性,再在田间试验中检测植株的____________是否得到提高。
(4)假如用得到的二倍体转基因耐旱植株自交,子代中耐旱与不耐旱植株的数量比为3∶1时,则可推测该耐旱基因整合到了__________________(填“同源染色体的一条上”或“同源染色体的两条上”)。
解析
(1)基因文库有两种:
基因组文库和部分基因文库,基因组文库含有生物的全部基因;
cDNA是以mRNA为模板逆转录得到的,因细胞中只有部分基因表达,所以cDNA文库含有生物的部分基因。
(2)建立基因文库后要根据目的基因的特性从中筛选出目的基因。
(3)目的基因与载体构建基因表达载体后,导入乙植物细胞(受体细胞),需要进行表达产物(蛋白质)和生物个体水平(耐旱性)等的检测。
(4)若是整合到同源染色体的两条上,则此耐旱二倍体植株为纯合子,自交后代不会发生性状分离,所以根据实验结果可推测:
该耐旱基因整合到了同源染色体的一条上。
答案
(1)全部 部分
(2)筛选 (3)乙 表达产物 耐旱性 (4)同源染色体的一条上
题组二 其他各省市高考选萃
3.(2014·
重庆理综,4)下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。
以下相关叙述,正确的是( )
A.②的构建需要限制性核酸内切酶和DNA聚合酶参与
B.③侵染植物细胞后,重组Ti质粒整合到④的染色体上
C.④的染色体上若含抗虫基因,则⑤就表现出抗虫性状
D.⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异
解析 构建表达载体需要限制酶和DNA连接酶,A错误;
③侵染植物细胞后,重组Ti质粒上的T-DNA整合到④的染色体上,B错误;
染色体上含有目的基因,但目的基因也可能不能转录或者不能翻译,或者表达的蛋白质不具有生物活性,C错误;
植株表现出抗虫性状,说明含有目的基因,属于基因重组,为可遗传变异,D正确。
答案 D
4.(2014·
福建理综,33)Rag2基因缺失小鼠不能产生成熟的淋巴细胞。
科研人员利用胚胎干细胞(ES细胞)对Rag2基因缺失小鼠进行基因治疗。
其技术流程如图:
(1)步骤①中,在核移植前应去除卵母细胞的________。
(2)步骤②中,重组胚胎培养到________期时,可从其内细胞团分离出ES细胞。
(3)步骤③中,需要构建含有Rag2基因的表达载体。
可以根据Rag2基因的________设计引物,利用PCR技术扩增Rag2基因片段。
用HindⅢ和PstⅠ限制酶分别在片段两侧进行酶切获得Rag2基因片段。
为将该片段直接连接到表达载体,所选择的表达载体上应具有________________酶的酶切位点。
(4)为检测Rag2基因的表达情况,可提取治疗后小鼠骨髓细胞的________,用抗Rag2蛋白的抗体进行杂交实验。
解析
(1)核移植过程中,体细胞核移植前要除去受体卵母细胞的细胞核,若不去掉卵母细胞的细胞核,细胞里面就有两个细胞核,造成遗传物质不能稳定表达。
(2)ES细胞是由早期胚胎(囊胚)的内细胞团分离出来的一类细胞。
(3)步骤③过程是将目的基因导入受体细胞(ES细胞)中,导入之前应构建基因表达载体。
在生物体外可通过PCR技术扩增目的基因,其条件是模板DNA、根据Rag2基因的核苷酸序列设计的引物、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶等,另据题干可知,获得Rag2目的基因需要用HindⅢ和PstⅠ两种限制酶,所选择的载体上应具有HindⅢ和PstⅠ酶的酶切位点,以便目的基因和载体能够连接在一起。
(4)检测目的基因是否翻译出相应蛋白质时,应采用抗原—抗体杂交技术,即提取蛋白质,用相应的抗体进行抗体-抗原杂交,看是否有杂交带。
答案
(1)细胞核
(2)囊胚 (3)核苷酸序列 HindⅢ和PstⅠ (4)蛋白质
1.(2015·
河北唐山重点中学联考,51)下图是从酵母菌获取某植物需要的某种酶基因的流程,结合所学知识及相关信息回答下列问题。
(1)图中cDNA文库________基因组文库(填“大于”“等于”或者“小于”)。
(2)①过程提取的DNA需要__________的切割,B过程是________。
(3)为在短时间内大量获得目的基因,可用________扩增的方法。
目的基因获取之后,需要进行________,其组成必须有__________________________
以及标记基因等,此步骤是基因工程的核心。
(4)将该目的基因导入某双子叶植物细胞,常采用的方法是________,其能否在此植物体内稳定遗传可以用________技术进行检测。
解析
(1)cDNA文库小于基因组文库。
(2)提取目的基因需要限制酶,逆转录法获得目的基因需要逆转录酶。
(3)短时间内大量获得目的基因,可用PCR技术扩增的方法。
基因表达载体的构建必须有目的基因、标记基因、启动子和终止子,基因表达载体的构建是基因工程的核心。
(4)将目的基因导入某双子叶植物细胞常采用的方法是农杆菌转化法,目的基因只有整合到植物细胞的染色体上才能在植物体内稳定遗传,可通过DNA分子杂交的方法对目的基因是否整合到染色体上进行检测。
答案
(1)小于
(2)限制酶 反转录(或逆转录)
(3)PCR技术 基因表达载体的构建 启动子、终止子、目的基因 (4)农杆菌转化法 DNA分子杂交
2.下图表示利用基因工程培育抗虫棉的过程,请据图回答下列问题。
(1)若限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—↓GATC—,限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—G↓GATCC—,那么在①过程中,应用限制酶________切割质粒,用限制酶________切割抗虫基因。
①过程在________(填“体内”或“体外”)进行。
(2)通过②过程得到的大肠杆菌涂布在含有________的培养基上,若大肠杆菌能够生长说明已导入了普通质粒或重组质粒,反之则说明没有导入,该培养基从功能方面属于________培养基。
(3)重组质粒导入大肠杆菌的目的是______________________。
(4)⑤过程所用技术称为________,从遗传学角度来看,根本原因是根细胞具有________________。
解析
(1)由图中目的基因片段两端的碱基序列可知,限制酶Ⅰ可以切割目的基因两端,限制酶Ⅱ能切割右端,故用酶Ⅰ(Ⅰ和Ⅱ)切割可以获得目的基因,质粒上的两个酶切位点,分别在两个抗性基因上,用酶Ⅰ切割,两个抗性基因全被破坏,用酶Ⅱ切割保留一个四环素抗性基因。
(2)根据重组质粒与普通质粒上抗性基因的种类可知,该选择培养基中应该添加四环素。
(4)⑤是将携带抗虫基因的根细胞培养成植株的过程,该过程为植物组织培养,细胞全能性是该技术的理论基础。
答案
(1)Ⅱ Ⅰ(Ⅰ和Ⅱ) 体外
(2)四环素 选择 (3)大量复制目的基因(抗虫基因) (4)植物组织培养 发育成完整个体的全部遗传物质
3.(2015·
福建质检,33)为探究SHH基因与角化囊肿发生的相关性,科研人员利用SHH基因的非模板链转录合成的RNA作为探针,进行分子杂交实验,以检测SHH基因在角化囊肿中的表达情况。
其基本流程如下图:
(Amp表示氨苄青霉素抗性基因;
LacZ基因被SHH基因插入后不表达)
请回答:
(1)重组载体中SHH基因转录合成RNA探针时,________(需要/不需要)启动子。
(2)步骤②中,用Ca2+处理大肠杆菌,使之成为________细胞,然后导入重组载体。
实验中,用添加氨苄青霉素的培养基培养大肠杆菌,未导入质粒的细菌将会死亡,原因是这些细菌不含有________基因。
(3)能表达LacZ基因的大肠杆菌在含有IPTG和X-gal的培养基上会形成蓝色菌落,易于识别。
根据上述原理可以初步判断________(蓝色/白色)菌落中的大肠杆菌为重组菌。
(4)将制备的探针加入角化囊肿切片中,探针将与______形成杂交带,进而判断SHH基因的转录情况。
解析
(1)重组载体中SHH基因表达需要启动子。
(2)大肠杆菌细胞用Ca2+处理后就成为感受态细胞;
能在添加氨苄青霉素的培养基上生存的细菌含有氨苄青霉素抗性基因,没有氨苄青霉素抗性基因的细菌将会死亡。
(3)能表达LacZ基因的大肠杆菌在含有IPTG和X-gal的培养基上会形成蓝色菌落,重组菌中LacZ基因被SHH基因插入后不表达,重组菌在含有IPTG和X-gal的培养基上会形成白色菌落。
(4)判断SHH基因的转录情况,也就是判断SHH基因是否转录出mRNA。
答案
(1)需要
(2)感受态 Amp(或氨苄青霉素抗性或抗性) (3)白色 (4)SHH转录的mRNA(只写mRNA不算对)
山东日照一模,35)下图表示利用细菌中抗虫基因获取抗虫玉米的部分过程(①~⑧表示操作流程,a、b表示分子,c~e表示培养过程,其中过程d表示细菌与玉米细胞混合培养),请回答。
(1)上述操
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