细胞增殖凋亡检验方法汇总Word文件下载.docx
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这个方法最大的缺点需要变性DNA才能与抗体结合,破坏了DNA双链结构r导致染色弥散、准确性降低等问题。
EdU检测法则基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性r适用于细胞増殖、细
胞标记示踪筈方
IEI
的研究,尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实
验。
EdU检测染料只有BrdU抗体大小的1/500,®
田胞内很容易就扩散,无需DNA变性。
rdU与EdU检测优缺点综合比较
BrdU
EdU
检测分子
大
很小
检测方式
免疫反应
化学反应
影响其他标记
是
否
DNA变性
需要
不需要
实验时间
过夜
2.5小时
检测灵敏度
一般
灵敏
4、WITT检测法&
CCK8检测法
MTT检测法反映细胞的能臺代谢「是检测细胞増殖活力的一种简便准确方法°
其原理是在活纟田胞生长和增殖过程中,线粒体内的脱氢酶可将黄色的MTT分解为蓝紫色的水不溶性的甲瓒(Formazan),并沉积在细胞中(死细胞无此功能。
DMSO溶解细胞中的紫色结品物,用酶联检测仪在490nni波长处检测其光密度值,可间接反映活细胞数量。
CCK8是MTT的升级版,CCK-8细胞活性检测试剂中含有WS「8(MTT的类似物),在电子耦合试割存在的情况下,可被线粒体中的脱氢酶还原成橙黄色的甲瓒(Formazan),用酶联检测仪在450nm波长处检测其光密度值.可间接反映活细胞数量。
细胞增殖越快,则颜色越深;
细胞青性越大,则颜色越浅。
CCK-8^MWST-8^
MTT法
还原后的Forma.zart是水溶性的(不需要溶解)
还原后的Formazari是水洛性的(需要加有机溶剂溶解)
重现性好
弃上清时,会损失小部分的■Formazan,故重复性略差
操作简便
操作繁琐v
测定波长:
450—490nm
490—550nm
1瓶溶液,无需预制,即开即用
需加有机溶剂溶解,工作量大
5.CFSE检测法
CFSE是一种可咅透细胞晅的荧光染料,可逆的与细胞内的氨基结台偶联到细胞蛋白质上■是种良好的细胞标记彻.当细胞分裂时,CFSE标记荧光可平均分配至两个予弋细胞中r因此CFSE荧光强席呈对逐级递减,可利用流式细胞仪对其进行分析。
轴昭代数惦加.CFSE荧光彌從辭
将纸胞昙液加入筈体积的CFSE工作液
4Amin苹至曲巾三用违壬昙药三:
◎+立M沛希目如冏日八市
37&
C^WWmin用40%体积的冷小牛血清立即终止标记
6.核抗原Ki・67染色法
KM57是目前较为肯走的核増殖标志物(它只参与増殖细胞核反应,其耒达壇强是细胞有丝分勲増殖活性增强的一个可K标记,硏究表明367的表达能可廉而迅速的反应恶性肿就的増值率。
Ki67几乎在疝心從灵的星證都有坂达,海常彌18周期的活以期(GT•5.(52.M)可以检浏到,乔在痒止潮(GO)IS测不現
二.细胞增殖一旦过分,就有可能形成肿瘤。
为了维持机体健康,细胞走向凋亡。
现将细胞凋亡检测方法介绍给大
一形态学检测
仁通过光学显微镜或倒置显微傥观窖细胞形态。
1)玉染色细胞
阔亡细胞的体积变小、变形,细胞腫芫整但出现发泡现球,细胞凋亡晚期可见周亡小体,贴壁细拒出现皱缩、变国、脱落。
2)染色细胞
常用吉姆萨染色、瑞氏染色等,凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化j核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。
Giemsastaining姬姆萨染液
(天青色索、伊红、次甲蓝的混合液)
瑞氏
Wright'
sstain
dpJ〔
o
也化
旬0®
彌亡小体
形态学特征:
■
(关蓝一伊红)
乙通过荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜观家细胞形态以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。
该法中常用的DNA特异性染料有:
Hoechst33342,Hoechst33258,DAP1.三种染料与DNA的结合是非嵌入式的,主要结合在DNA的A・T碱基区。
紫夕卜光激发时发射明亮的蓝色荧光。
细胞凋亡中细胞核染色质的形态学改变分为三期:
I期的细胞核呈波纹状或折缝样,部分染色质岀现浓缩状态;
II8期细胞核的染色质高康凝聚、边缘化;
IIb期的细胞核裂解为碎块,产生阔亡小体。
controIstageI
stageIlastage1ib
dapi染色
厝11HbUii^r:
处任Mi的彤◎化
Hoechst^与DNA特界结合的活性染料,储存液用蒸溜水配成Img/mlffj浓度'
使用时用PBS稀禅成终浓度为黔
DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的诛色.储存液川蒸窗水配成im号伽啲浓度.使用终浓度-般为0.5~lmg/mL
3・通过谤射电子显微镜观察细胞形态
凋亡细匏体秧变小,表面陋毛消失「细胞质浓缩。
凋亡I期(pro-apoptosisnuclei)的细胞核内染色匪高度盘绕‘岀现许多称为气冗现象的空泡结
构;
IIa期细胞核的染色质高度澀聚、
边缘化;
细趙凋亡的晚期rffl
核裂解为碎块,产生凋亡
小体。
controlstageIla
proapoptosisnuclei<
im
国2电f眾徵憧戏索Jurkadffljfe浏匚过F冲檢圾色质的瞬态学黒空
二AnnexinV/PI染色
周亡细胞的细胞表面的改变之一是歲脂酰鉉氨酚(PS)从细胞睡内转移到细胞胆外•便PS暴靈在细胞脛夕卜表面。
Annexm▽是一种Ca+依載的磷脂结合雷白,对PS有高癢的亲和性亠P?
(碩化丙噓)是一种对DMA染色的细胞核染色试讯]「在贡入dsDNA后釋放红色荧光。
尽普PI下绽通过活细胞腫「但却能穿过破垠的细跑膜而对核染色,
・广“讥朗细*twirrjfiwi/死亡细
ldn»
&
CMIW-O«
A)
mmo・t
三DNA的片段化
凋亡细胞DNA断裂点均有规律的茨生在F刻傑之闾,出现18MOObpDNA片段,而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片段,利用此特征可以确走群体细胞的死亡,井可与坏死细膽区别。
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四Tunel检测法
细胞;
周亡中,染色体DNA双链或单链断裂而产生大臺的粘性3-0H末端,可在脱雪核糖核昔酸末鑰转移酶(TdT)的作用下,将脱氧核糖核巷酸和荧光素、过氧化物詰、减性漆酸蒲或生物素形成的衍生物标记到33H末端,从而可逬行凋亡细胞的检测。
NOAMAL
APO*TO$t$
DNA
LEGfNO
TdTMo^x>
fAledNkk«
Mtde
B«
c*fcn
•SU«
(MaMdhA
五线粒体膜电位
红粒体在细胞凋亡中起着枢纽作用,线粒体跨腹电位的下降,被认为是细胞凋亡级联反应过程丰最早发生的事件,一旦线粒休崩溃.则细胞周亡不可逆转。
因而,线粒体跨鹿电位旳存在,使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodanne123、JC-1.TMRM等可接合到线粒体基质,其荧光的塔强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。
方法:
将正常培养时细挪D诱导;
周亡细胞加入终诙店为Rhodamine123(1mM)、JC-
1(1mM).TMRM(10DnM),37°
C平衡30min,流式细胞检测细胞的荧光理度。
原理:
JC-1染料在正常细胞内聚集在线粒体内■形成多聚休,发红色荧光;
而在凋亡细胞内.由于线粒体膜电位的破坏,不能聚集到线粒体内•以单体的形式存在于胞质内发绿色荧光。
FlowcytometricanalysisofJurkatcellsusingtheMitoProbe™JC-1AssayKit.Jurkatcellswerestainedwith2pMJC-1for15mmat37C,5%CO2,andthenwashedwithphosphate-bufferedsaline(PBS)andanalyzedonaflowcytometerusing488nmexcitationwith530nmand585nmbandpassemissionfiltors.(A)Untrootedculturedcolls.(B)Cellsinducedtoapoptosiswith10pMcamotothecinfor4hrat37C・
六细胞色素C穆放
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七Caspase活性检测
Caspase家族在周亡信号转导対许多途径中发挥功能。
Caspase-3IE^以醍原(32kD)的形式存在于担浆中,在澹亡早期阶段祓激活,活化的Caspase-3由两个大亚墓(17kD)和两个小亚基(12kD)组成,裂解相应的胞浆胞核底物,最终导致细胞凋亡,但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞,caspase-3的活性明显下降。
Nucl9U9
Entmc^lular
Caspase9
Caspaso6
*CrmA
J\凋亡相关蛋白检测
-促凋亡分子
Bax,Bel-Xs,Bak,Bad,Bid,AIF,Apaf・l等
・抑制凋亡分子
Bcl・2.BcML和bcr/ablkinase
•相关信号通路分子检测抗凋亡信号通路
PI5K-Aktpathway
NIK-NF-kBpathway
促凋亡信号通路
MKK-JNKpathway
Fas-FADDpathway
P53pathway
综上,细胞凋亡分析总体标准:
凋亡是多原因、多通路参与过程,不能依据单一指标来判定细胞凋亡;
需多指标同时检测。
凋亡细胞不一样时间出现凋亡事件不一样,而每个指征维持一段时间,则需要在不一样时间点进行釆样,以确保检测结果正确性。
试验需设定阳性&
阴性对照,避免出现假阳性或假阴性。
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