最新大肠杆菌及菌落总数Word文档下载推荐.docx

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1.将内层锅去处，再向外层锅中加入适量的水，使水面与三角架相平为宜。

2.放回内层锅，并加入要灭菌的培养皿、试管、烧杯等物品（注意不要装得太挤，以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果）。

3.加盖，并将盖上的排气管插入内层的排气槽内，再2两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

4.本实验用0.1MPa，121.5℃，20min灭菌。

灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。

（2）大肠菌群的测定；

1）培养基：

①乳糖胆盐蛋白胨培养基：

蛋白胨20g，猪胆盐（或牛、羊胆盐）5g，乳糖10g，

0.04%溴甲酚紫水溶液25mL，水1000mL，pH7.4。

制法：

将蛋白胨、胆盐从乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装，每瓶50mL或每管5mL，并倒置放入一个杜氏小管，l15℃灭菌15min。

双倍或三倍乳糖胆盐蛋白胨培养基：

除水以外，其余成分加倍或取三倍用量。

②伊红美蓝琼脂培养基：

蛋白胨10g，乳糖10g，K2HP042g，2％伊红水溶液20Ml，0.65％美蓝水溶液lOmL，琼脂17g，水1000mL，pH7.1。

将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶于水中，校正pH后分装．121℃灭菌15min备用。

临用时加入乳糖并熔化琼脂，冷至50-55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。

③乳糖发酵管：

除不加胆盐外．其余同乳糖胆盐蛋白胨培养基。

2）器材：

灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。

（四）实验方法

（1）水样的采集：

1）自来水：

先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，再开放水龙头使水流5min，以灭菌三角瓶接取水样以备分析。

2）池水、河水、湖水等地面水源水：

在距岸边5m处，取距水面10-15cm的深层水样，先将灭菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。

如果不能在2h内检测的，需放入冰箱中保存。

（2）细菌总数的测定：

1）水样稀释及培养：

①按无菌操作法，将水样作10倍系列稀释：

⑦根据对水样污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度（饮用水如自来水、深井水等，一般选择1、1:

10两种浓度；

水源水如河水等，比较清洁的可选择1:

10、1:

100、1:

1000三种稀释度；

污染水—被选择1:

1000、1:

10000三种稀释度），吸取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作3个重复。

③将熔化后保温度45℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿，每皿约15mL，并趁热转动平皿混合均匀。

④待琼脂凝固后，将平皿倒置于37℃培养箱内培养24±

1h后取出，计算平皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即得1mL水样中所含的细菌菌落总数。

2）计算方法：

作平板计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。

在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。

3）计数的报告：

①平板菌落数的选择：

选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定标准。

一个稀释度使用两个重复时，应选取两个平板的平均数。

如果一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板计数作为该稀释度的菌数。

若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，可计算半个平板后乘2以代表整个平板的菌落数。

②稀释度的选择：

a.应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，乘以该稀释倍数报告之（表1例1）。

b．若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30-300之间，则视二者之比如何来决定。

若其比值小于2，应报告其平均数；

若比值大于2，则报告其中较小的数字（l例2、例3）。

c．若所有稀释度的平均菌落均大于300，则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（l例4）。

d．若所有稀释度的平均菌落数均小于30、则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（1例5）。

e.若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之（表1例6）。

f.若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，则以最接近30或300的平均菌落数乘以该稀释倍数报告之（表l例7）。

③细菌总数的报告：

细菌的菌落数在l00以内时，按其实有数报告；

大于100时，用二位有效数字，在二位有效数字后面的数字，以四舍五入方法修约。

为了缩短数字后面的0的个数，可用10的指数来表示，如表1“报告方式”一栏所示。

（3）大肠菌群的测定（多管发酵法）：

表1稀释度的选择及细菌数报告方式

稀释度及菌落数

两稀释度之比

菌落总数/（cfu/g或cfu/mL）

报告方式（菌落总数）/（cfu/mL或cfu/g）

10-1

10-2

10-3

1

多不可计

164

20

-

16400

16000或1.6×

104

2

295

46

1.6

37750

38000或3.8×

3

271

60

2.2

27100

27000或2.7×

4

313

313000

310000或3.1×

105

5

27

11

270

270或

6

＜10

7

305

12

30500

31000或3.1×

1）生活饮用水或食品生产用水的检验：

①初步发酵试验：

在2个各装有50mL的3倍浓缩乳糖胆盐蛋白胨培养液（可称为三倍乳糖胆盐）的三角瓶中（内有倒置杜氏小管），以无菌操作各加水样100mL。

在10支装有5mL的三倍乳糖胆盐的发酵试管中（内有倒置小管），以无菌操作各加入水样10mL。

如果饮用水的大肠菌群数变异不大，也可以接种3份100mL水样。

摇匀后，37℃培养24h。

②平板分离：

经24h培养后，将产酸产气及只产酸的发酵管（瓶），分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板（EMB培养基）上，37℃培养18—24h。

大肠菌群在EMB平板上，菌落呈紫黑色，具有或略带有或不带有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深；

挑取符合上述特征的菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检。

③复发酵试验：

将革兰氏阴性无芽胞杆菌的菌落的剩余部分接于单倍乳糖发酵管中，为防止遗漏，每管可接种来自同一初发酵管的平板上同类型菌落1—3个，37℃培养24h，如果产酸又产气者，即证实有大肠菌群存在。

④报告：

根据证实有大肠菌群存在的复发酵管的阳性管数，查表107-2（或表107-3），报告每升水样中的大肠菌群数（MPN）。

2）水源水的检验：

用于检验的水样量，应根据预计水源水的污染程度选用下列各量。

①严重污染水：

1，0．1，0．01．0．00lmL各1份。

②中度污染水：

10．1，0．1，0．01mL各1份。

③轻度污染水：

100，10，1，0．1mL各l份。

④大肠菌群变异不大的水源水：

10mLl0份。

表2大肠菌群检索表（饮用水）

备注

每升水样中大肠菌群数

＜3

接种水样总量300mL（100mL2份，10mL10份）

8

18

13

38

14

24

52

30

70

22

36

92

43

120

31

51

161

9

230

10

40

69

＞230

表3大肠菌群数变异不大的饮用水

阳性管数

接种水样总量300mL（3份100mL）

＞18

表4大肠菌群检索表（严重污染水）

接种水样量/mL

0.1

0.01

0.001

＜900

接种水样总量为1.111（1，0.1，0.01，0.001mL各一份）

+

900

950

1800

1900

2200

2300

2800

9200

9400

18000

23000

96000

238000

＞238000

表5大肠菌群检索表（中度污染水）

＜90

接种水样总量为11.11（10，1，0.1，0.01mL各一份）

90

95

180

190

220

280

920

940

9600

23800

＞23800

表6大肠菌群检索表（轻度污染水）

100

＜9

接种水样总量为111.1（100，10，1，0.1mL各一份）

9.5

19

23

28

94

960

2380

＞2380

表7大肠菌群变异不大的水源水

160

接种水样总量100mL（10mL10份）

操作步骤同生活用水或食品生产用水的检验。

同时应注意，接种量1mL及1mL以内用单倍乳糖胆盐发酵管；

接种量在1mL以上者，应保证接种后发酵管（瓶）中的总液体量为单倍培养液量。

然后根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数，查表107-4、表l07-5、表107-6或表107-7，报告每升水样中的大肠菌群数（MPN）。

附：

滤膜法

滤膜法所使用的滤膜是一种微孔滤膜。

将水样注入已灭菌的放有滤膜的滤器中，经过抽滤，细菌即被均匀地截留在膜上，然后将滤膜贴于大肠菌群选择性培养基上进行培养。

再鉴定滤膜上生长的大肠菌群的菌落，计算出每升水样中含有的大肠菌群数（MPN）。

（1）准备工作：

1）滤膜灭菌：

将3号滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中蒸煮灭菌3次，每次15min。

前两次煮沸后需换无菌水洗涤2-3次，以除去残留溶剂。

2）滤器灭菌：

准备容量为500mL的滤器，用点燃的酒精棉球火焰灭菌，也可用121℃高压灭菌20min。

3）培养：

3）培养：

将品红亚硫酸钠培养基放入37℃培养箱内预温30-60min。

（2）过滤水样：

1）用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将祖糙面向上贴放于已灭菌的滤床上，轻轻地固定好滤器漏斗。

水样摇匀后，取333mL注入滤器中，加盖，打开滤器阀门，在—50kPa压力下进行抽滤。

2）水样滤完后再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用无菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在品红亚硫酸钠培养基上，滤膜截留细菌面向上与培养基完全紧贴，两者间不得留有间隙或气泡。

若有气泡需用镊子轻轻压实，倒放在37℃培养箱内培养16-18h。

（3）结果判定：

1）挑选符合下列特征的菌落进行革兰氏染色，镜检。

①紫红色，具有金属光泽的菌落。

②深红色，不带或略带金属光泽的菌落。

③淡红色，中心颜色较深的菌落。

2）凡是革兰氏阴性无芽胞杆菌，需再接种于乳糖蛋白胨半固体培养基，37℃培养6-8h，产气者，则判定为大肠菌群阳性。

3）1L水样中大肠菌群数等于滤膜法生长的大肠菌群菌落数乘以3