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1.将内层锅去处,再向外层锅中加入适量的水,使水面与三角架相平为宜。
2.放回内层锅,并加入要灭菌的培养皿、试管、烧杯等物品(注意不要装得太挤,以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果)。
3.加盖,并将盖上的排气管插入内层的排气槽内,再2两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓,使螺栓松紧一致,勿使漏气。
4.本实验用0.1MPa,121.5℃,20min灭菌。
灭菌所需时间到后,切断电源,让灭菌锅内温度自然下降,当压力表的压力降至“0”时,打开排气阀,旋松螺栓,打开盖子,取出灭菌物品。
(2)大肠菌群的测定;
1)培养基:
①乳糖胆盐蛋白胨培养基:
蛋白胨20g,猪胆盐(或牛、羊胆盐)5g,乳糖10g,
0.04%溴甲酚紫水溶液25mL,水1000mL,pH7.4。
制法:
将蛋白胨、胆盐从乳糖溶于水中,校正pH,加入指示剂,分装,每瓶50mL或每管5mL,并倒置放入一个杜氏小管,l15℃灭菌15min。
双倍或三倍乳糖胆盐蛋白胨培养基:
除水以外,其余成分加倍或取三倍用量。
②伊红美蓝琼脂培养基:
蛋白胨10g,乳糖10g,K2HP042g,2%伊红水溶液20Ml,0.65%美蓝水溶液lOmL,琼脂17g,水1000mL,pH7.1。
将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶于水中,校正pH后分装.121℃灭菌15min备用。
临用时加入乳糖并熔化琼脂,冷至50-55℃,加入伊红和美蓝溶液,摇匀,倾注平板。
③乳糖发酵管:
除不加胆盐外.其余同乳糖胆盐蛋白胨培养基。
2)器材:
灭菌三角瓶,灭菌的具塞三角瓶,灭菌平皿,灭菌吸管,灭菌试管等。
(四)实验方法
(1)水样的采集:
1)自来水:
先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌,再开放水龙头使水流5min,以灭菌三角瓶接取水样以备分析。
2)池水、河水、湖水等地面水源水:
在距岸边5m处,取距水面10-15cm的深层水样,先将灭菌的具塞三角瓶,瓶口向下浸入水中,然后翻转过来,除去玻璃塞,水即流入瓶中,盛满后,将瓶塞盖好,再从水中取出。
如果不能在2h内检测的,需放入冰箱中保存。
(2)细菌总数的测定:
1)水样稀释及培养:
①按无菌操作法,将水样作10倍系列稀释:
⑦根据对水样污染情况的估计,选择2-3个适宜稀释度(饮用水如自来水、深井水等,一般选择1、1:
10两种浓度;
水源水如河水等,比较清洁的可选择1:
10、1:
100、1:
1000三种稀释度;
污染水—被选择1:
1000、1:
10000三种稀释度),吸取1mL稀释液于灭菌平皿内,每个稀释度作3个重复。
③将熔化后保温度45℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿,每皿约15mL,并趁热转动平皿混合均匀。
④待琼脂凝固后,将平皿倒置于37℃培养箱内培养24±
1h后取出,计算平皿内菌落数目,乘以稀释倍数,即得1mL水样中所含的细菌菌落总数。
2)计算方法:
作平板计数时,可用肉眼观察,必要时用放大镜检查,以防遗漏。
在记下各平板的菌落数后,求出同稀释度的各平板平均菌落数。
3)计数的报告:
①平板菌落数的选择:
选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定标准。
一个稀释度使用两个重复时,应选取两个平板的平均数。
如果一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板计数作为该稀释度的菌数。
若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,可计算半个平板后乘2以代表整个平板的菌落数。
②稀释度的选择:
a.应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度,乘以该稀释倍数报告之(表1例1)。
b.若有两个稀释度,其生长的菌落数均在30-300之间,则视二者之比如何来决定。
若其比值小于2,应报告其平均数;
若比值大于2,则报告其中较小的数字(l例2、例3)。
c.若所有稀释度的平均菌落均大于300,则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(l例4)。
d.若所有稀释度的平均菌落数均小于30、则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(1例5)。
e.若所有稀释度均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数报告之(表1例6)。
f.若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间,则以最接近30或300的平均菌落数乘以该稀释倍数报告之(表l例7)。
③细菌总数的报告:
细菌的菌落数在l00以内时,按其实有数报告;
大于100时,用二位有效数字,在二位有效数字后面的数字,以四舍五入方法修约。
为了缩短数字后面的0的个数,可用10的指数来表示,如表1“报告方式”一栏所示。
(3)大肠菌群的测定(多管发酵法):
表1稀释度的选择及细菌数报告方式
稀释度及菌落数
两稀释度之比
菌落总数/(cfu/g或cfu/mL)
报告方式(菌落总数)/(cfu/mL或cfu/g)
10-1
10-2
10-3
1
多不可计
164
20
-
16400
16000或1.6×
104
2
295
46
1.6
37750
38000或3.8×
3
271
60
2.2
27100
27000或2.7×
4
313
313000
310000或3.1×
105
5
27
11
270
270或
6
<10
7
305
12
30500
31000或3.1×
1)生活饮用水或食品生产用水的检验:
①初步发酵试验:
在2个各装有50mL的3倍浓缩乳糖胆盐蛋白胨培养液(可称为三倍乳糖胆盐)的三角瓶中(内有倒置杜氏小管),以无菌操作各加水样100mL。
在10支装有5mL的三倍乳糖胆盐的发酵试管中(内有倒置小管),以无菌操作各加入水样10mL。
如果饮用水的大肠菌群数变异不大,也可以接种3份100mL水样。
摇匀后,37℃培养24h。
②平板分离:
经24h培养后,将产酸产气及只产酸的发酵管(瓶),分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板(EMB培养基)上,37℃培养18—24h。
大肠菌群在EMB平板上,菌落呈紫黑色,具有或略带有或不带有金属光泽,或者呈淡紫红色,仅中心颜色较深;
挑取符合上述特征的菌落进行涂片,革兰氏染色,镜检。
③复发酵试验:
将革兰氏阴性无芽胞杆菌的菌落的剩余部分接于单倍乳糖发酵管中,为防止遗漏,每管可接种来自同一初发酵管的平板上同类型菌落1—3个,37℃培养24h,如果产酸又产气者,即证实有大肠菌群存在。
④报告:
根据证实有大肠菌群存在的复发酵管的阳性管数,查表107-2(或表107-3),报告每升水样中的大肠菌群数(MPN)。
2)水源水的检验:
用于检验的水样量,应根据预计水源水的污染程度选用下列各量。
①严重污染水:
1,0.1,0.01.0.00lmL各1份。
②中度污染水:
10.1,0.1,0.01mL各1份。
③轻度污染水:
100,10,1,0.1mL各l份。
④大肠菌群变异不大的水源水:
10mLl0份。
表2大肠菌群检索表(饮用水)
备注
每升水样中大肠菌群数
<3
接种水样总量300mL(100mL2份,10mL10份)
8
18
13
38
14
24
52
30
70
22
36
92
43
120
31
51
161
9
230
10
40
69
>230
表3大肠菌群数变异不大的饮用水
阳性管数
接种水样总量300mL(3份100mL)
>18
表4大肠菌群检索表(严重污染水)
接种水样量/mL
0.1
0.01
0.001
<900
接种水样总量为1.111(1,0.1,0.01,0.001mL各一份)
+
900
950
1800
1900
2200
2300
2800
9200
9400
18000
23000
96000
238000
>238000
表5大肠菌群检索表(中度污染水)
<90
接种水样总量为11.11(10,1,0.1,0.01mL各一份)
90
95
180
190
220
280
920
940
9600
23800
>23800
表6大肠菌群检索表(轻度污染水)
100
<9
接种水样总量为111.1(100,10,1,0.1mL各一份)
9.5
19
23
28
94
960
2380
>2380
表7大肠菌群变异不大的水源水
160
接种水样总量100mL(10mL10份)
操作步骤同生活用水或食品生产用水的检验。
同时应注意,接种量1mL及1mL以内用单倍乳糖胆盐发酵管;
接种量在1mL以上者,应保证接种后发酵管(瓶)中的总液体量为单倍培养液量。
然后根据证实有大肠菌群存在的阳性管(瓶)数,查表107-4、表l07-5、表107-6或表107-7,报告每升水样中的大肠菌群数(MPN)。
附:
滤膜法
滤膜法所使用的滤膜是一种微孔滤膜。
将水样注入已灭菌的放有滤膜的滤器中,经过抽滤,细菌即被均匀地截留在膜上,然后将滤膜贴于大肠菌群选择性培养基上进行培养。
再鉴定滤膜上生长的大肠菌群的菌落,计算出每升水样中含有的大肠菌群数(MPN)。
(1)准备工作:
1)滤膜灭菌:
将3号滤膜放入烧杯中,加入蒸馏水,置于沸水浴中蒸煮灭菌3次,每次15min。
前两次煮沸后需换无菌水洗涤2-3次,以除去残留溶剂。
2)滤器灭菌:
准备容量为500mL的滤器,用点燃的酒精棉球火焰灭菌,也可用121℃高压灭菌20min。
3)培养:
3)培养:
将品红亚硫酸钠培养基放入37℃培养箱内预温30-60min。
(2)过滤水样:
1)用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分,将祖糙面向上贴放于已灭菌的滤床上,轻轻地固定好滤器漏斗。
水样摇匀后,取333mL注入滤器中,加盖,打开滤器阀门,在—50kPa压力下进行抽滤。
2)水样滤完后再抽气约5s,关上滤器阀门,取下滤器,用无菌镊子夹取滤膜边缘部分,移放在品红亚硫酸钠培养基上,滤膜截留细菌面向上与培养基完全紧贴,两者间不得留有间隙或气泡。
若有气泡需用镊子轻轻压实,倒放在37℃培养箱内培养16-18h。
(3)结果判定:
1)挑选符合下列特征的菌落进行革兰氏染色,镜检。
①紫红色,具有金属光泽的菌落。
②深红色,不带或略带金属光泽的菌落。
③淡红色,中心颜色较深的菌落。
2)凡是革兰氏阴性无芽胞杆菌,需再接种于乳糖蛋白胨半固体培养基,37℃培养6-8h,产气者,则判定为大肠菌群阳性。
3)1L水样中大肠菌群数等于滤膜法生长的大肠菌群菌落数乘以3
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