精选基于重叠延伸PCR法的定点突变技术 doc资料Word格式.docx
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StemCell,Changsha,410078,China
ABSTRACTObjective:
Toestablishafast,savingmethodforsite-directedmutagenesis.Methods:
OverlapextensionPCRwasused.Briefly,targetmutationwasintroducedintoprimers,andthetwopreviousPCRproductswereusedastemplateforthethirdPCR.ThefinalPCRsegmentwithtargetmutantwasthenclonedintopMD?
18-Tvectorforsequencing.Results:
DNAsequencingshowedthatthetargetsiteATTGGhadbeenchangedintoATTTT.Conclusion:
Site-directedmutagenesiswassuccessfullyimplementedbasedontheoverlapextensionPCRwhichisafastandsavingmethod.
Keywords:
OverlapextensionPCR;
Site-directedmutagenesisChineseLibraryClassification:
Q75,78,R392Documentcode:
ArticleID:
1673-6273(202103-411-02
前言
定点突变(Site-directedmutagenesis,SDM是指通过聚合
酶链式反应(PCR等方法在目的DNA片段的特定位点中引入
碱基改变,如插入、
缺失、点突变等。
定点突变能迅速、高效地提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征,是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具;
它还能改造启动子或DNA作用元件,是基因研究工作中一种非常有用的手段。
如何在体外准确而高效地改变目的位点成为研究者最为关心的问题。
本文以插入人类CDCA8基因[1,2,3]正常启动子片段的报告
基因质粒pGL3-269为模板,
采用重叠延伸PCR定点突变技术快速准确地将CDCA8启动子上的一个NFY结合位点[4,5]突变,并将获得的突变启动子片段克隆到pMDTM18-T载体上,为该片段的进一步克隆和功能的研究提供了便利。
1材料与方法
菌种E.coliDH5α和带有荧光素酶报告基因的基础质粒pGL3-269由本研究小组前期构建,插入片断为人类CDCA8基因ATG上游-53bp~-321bp区段(269bp,为正常野生型。
pGL3-Basicvector购自Promega公司,质粒抽提试剂盒、凝胶
纯化试剂盒、
和NheⅠ酶切位点;
Rm和Fm为两条完全互补的引物,且引入
了突变位点,它们分别与侧翼引物F和R搭配扩增突变位点及其两侧的启动子片段。
表1引物
Table.1Primersusedinthisstudy
注:
阴影示突变碱基,下划线示酶切位点KpnⅠ(ggtacc和NheⅠ(gctagc。
Notes:
Thebasesforsubstitutionswereshadowed,therestrictionsitesKpn
Ⅰ(ggtaccandNheⅠ(gctagcwereunderlined.
411·
·
重叠延伸PCR法是通过3个PCR反应来完成的(如图
1。
首先以基础质粒pGL3-269为模板,用正向侧引物F和突变
引物Rm进行PCR1扩增(采用Pfu酶,产物含突变位点及其
上游片段;
此外也以基础质粒pGL3-269为模板,用反向侧引物
R和突变引物Fm进行PCR2扩增(采用Pfu酶,产物含突变
位点及其下游片段。
PCR1和PCR2可同时分别进行,产物经琼
脂糖凝胶电泳分离、试剂盒回收纯化后等比例混合。
取上述混
合物为模板,用正、反向侧引物F和R进行PCR3扩增(采用
Taq酶,产物即为引入了目的突变的269bp启动子片段。
以上
PCR循环条件均为94℃预变性5min;
94℃变性30s,60℃退
火30s,72℃延伸20s,共30个循环;
末次循环后,72℃再延伸
2min(Pfu或10min(Taq。
PCR反应总体积为20~50μL:
1×
物,2μL模板。
将突变启动子片段16℃过夜连接到pMDTM18-TVector,
连接产物经转化、涂板后,挑取白色菌落,摇菌过夜,经菌液
PCR(侧翼引物F和R验证为阳性克隆后,抽提质粒进行酶切
检验和测序鉴定。
酶切体系为10μL:
Buffer1.0μL,质粒
20ng/μL,内切酶KpnⅠ和NheⅠ各0.1U/μL,37℃,反应2h。
2结果
2%琼脂糖凝胶电泳显示,重叠延伸PCR后获得了正确的
突变启动子片段269m(图2A。
将此片段连接到pMDTM18-T
vector质粒,转化涂板挑克隆后,应用菌液进行PCR鉴定(图
2B,选取第3泳道的阳性重组质粒进行酶切检验和测序分析,
结果显示载体连接正确,酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳出现
两条带:
约2700bp载体片段和269bp启动子插入片段(图2D,
与预期结果一致;
目的位点突变成功,已由ATTGG突变为
ATTTT(图2C。
3讨论
本研究基于PCR的方法,快速有效的在基因特定位点引
入特定突变。
重叠延伸PCR法适用于DNA片段中间区域的碱
基改变,它采用互补引物(含有使重构基因所需的遗传改变的
碱基掺入,如点突变、插入或缺失,使两次PCR产物之间形成
了重叠链从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸拼接起
来。
含有目的碱基改变的引物设计是基于PCR方法成功进行
定点突变的关键,突变点最好是位于引物的中间部位或5’端,
尽量避免出现在3’端。
突变引物Fm及Rm为中间引物,它们
可以部分重叠(至少10bp完全匹配,也可以如本研究中Fm
和Rm完全重叠。
侧翼引物F和R的5’端分别引入KpnⅠ和
NheⅠ酶切位点,为后续突变片段的克隆提供方便。
另外,分别
用引物F和Rm及Fm和R进行配对PCR时一定要用pfu酶,
不要用Taq酶,因为Taq酶会在PCR产物末端加A,从而可能
会使产物移码突变。
本研究通过三次PCR即成功的将CDCA8启动子上的一
个NFY结合位点进行了突变,相比传统的体外突变技术及试
剂盒法更加的简便和经济。
参考文献(References
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anovel
chromosomalpassengerrequiredforstabilityofthebipolarmitotic
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ChromosomalPassengerComplexRequiresaTernarySubcomplexof
Borealin,Survivin,andtheN-TerminalDomainofINCENP[J].Mol
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416-444
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Manual[M].Beijing:
SciencePress,1999:
416-444.
图1重叠延伸PCR定点突变示意图(黑点示突变位点
Fig.1Site-directedmutagenesisbyoverlapextensionPCR
(blackdotsrepresentsubstitutionsites
图2突变启动子片段的克隆与鉴定。
(A突变PCR结果;
(BpMD?
18-T-269m菌液PCR鉴定结果,泳道2~3、7~8为阳性克隆,泳道1、4~6
为阴性克隆;
(CpMDTM18-T-269m质粒测序结果,黑框示NFY结合位
点,阴影示突变碱基;
(DKpnⅠ、NheⅠ双酶切pMDTM18-T-269m质粒
结果。
Fig.2Cloneandidentificationofthemutantpromoterfragment.(A
ProductsobtainedbyoverlapextensionPCR;
(BidentificationofpMDTM
18-T-269mbyPCR,Lanes2~3,7~8:
positiveclones;
Lanes1,4~6:
negativeclones;
(CidentificationofpMDTM18-T-269mbysequencing,
boxindicatedbindingsitesofNFY,thebasesforsubstitutionswere
shadowed;
(DKpnⅠ,NheⅠDoubledigestionofpMDTM18-T-269m
plasmid.
412
1前言
计算粘性自由面绕流问题是船舶水动力学领域最重要的课题之一,一直是一项挑战性的任务。
目前随着CFD数值技术的不断提高和计算机硬件的飞速发展,近年来“数值水池”发展很快,但网格生成技术和自由液面的模拟方法仍是关键技术之一。
结构网格技术成熟、壁面粘性模拟能力强等优点,因此在非结构、笛卡儿直角网格逐渐盛行的今天,仍然是船舶CFD计算的首选。
为了更好地利用结构网格的优点,人们迫切希望开发结构网格的自动化生成方法,于是出现了多块结构化网格生成方法,但该方法仍然没有真正解决结构网格的自动化生成技术。
现在尽管商业软件(如Fluent/Gambit在非结构网格、多块结构网格及动网格方面具有强大功能,但由于船舶CFD主要解决两相流问题,要求在自由液面附近的网格具有很高的分辨率,这一特殊性使得商用软件在船舶六自由度运动、具有较大航态变化的高性能船舶(如快艇、高速复合船型、多体相对运动以及限制条件情况等方面模拟具有局限性,若再考虑带附体、边界限制的影响,CFD模拟更是困难。
重叠网格(chimeragrid、oversetgrid、overlapgrid的出现使结构网格的自动化成为可能,上面的难题可获得较容易的解决:
如远场背景网格采用笛卡儿直角网格以保证自由液面的网格分辨率,各物体采用贴体网格,这样就可解决船舶CFD模拟问题。
在船舶CFD中模拟中,自由面处理方法可分为自由面追踪法(freesurfacetracing和自由面捕捉法(freesurfacecapturing。
自由面追踪法采用移动网格技术,该方法使网格变形以适合自由面边界的形状,但对自由面大幅变形情况的数值模拟比较困难。
自由液面捕捉方法用混合的空间网格并且通过解决边界面处的运输方程来捕获自由面位置,最常用的界面捕获方法是MAC方法、VOF方法、Levelset方法和VOF/Levelset混合方法。
本文采用单相LevelSet方法来模拟自由液面形状。
2重叠网格方法
重叠网格方法将复杂的流动区域分成几何边界比较简单的子区域,各子区域中的计算网格独立生成,彼此存在着重叠、嵌套或覆盖关系,流场信息通过插值在重叠区边界进行匹配和耦合。
重叠网格即拥有结构网格逻辑关系简单、流场计算精度高、效率高、壁面粘性模拟能力强等优点,更弥补了结构网格对外形适应能力差的缺点。
重叠网格的应用越来越广泛,国外比较著名的重叠代码:
如NASA的PEGASUS、ARL的SUGGAR及SUGGAR++、OVERTURE等,并且还在不断地推陈出新。
1
2重叠网格方法的最终目标是建立各重叠网格间的耦合关系,为各区域流场计算提供边界信息的传递服务。
如图1所示:
网格1落入网格2物面内的点被标记为洞内点而不参与流场的计算。
网格1中与洞点相邻的点为洞边界点(图1中的方点,这些点通过插值接受从网格2传递的流场信息。
相应地,网格2的外边界点(图1中的圆点也通过插值接受从网格1传递的流场信息,任意变量f由相应的六面体贡献单元采用trilinear方法插值获得(1式。
网格1的洞边界点和网格2的外边界插值点之间的区域为重叠区域。
图2为典型单体船静态的船舶重叠网格。
=++++1121415ff(-ffdi
+(-ffdj
+(-ffdk
+(f-fffdjdk
+(-fff+fff−78ffdidjdk
(1
其中:
di,dj,dk为[0,1]间的插值权系数。
图1重叠网格示意图
网格1的洞边界点网格2的
固壁边界
网格2的外
边插值点
网格2
网格1
3
重叠网格生成的工作并不是简单地等于各子网格的生成,更为重要的内容是确定各子网格之间的重叠关系,以及确定各子网格之间的数据插值传递关系,因此重叠网格包含两个主要的步骤:
挖洞和插值。
挖洞的目的是在流场计算前从网格中屏蔽掉一些不必要或者无实际意义的部分(如物体壁面内部。
具体而言,是在需要屏蔽的区域周围设定挖洞面,然后将落入挖洞面内的网格点标识出来,并在CFD计算过程中予以舍弃。
挖洞方法可以分为指定挖洞面法、洞映射方法以及叉树方法,本文采用洞映射方法。
寻点是在网格中寻找插值点的贡献单元。
寻找贡献单元最简单、最可靠的方法是遍历整个网格域,直到找到正确的网格单元。
但是,这种方法的效率是最低的,对于数据量稍大的网格,其搜索速度异常缓慢。
利用优秀的数据结构可成量级地提高寻点速度,现在常用的方法为叉树法和ADT方法,本文采用ADT方法。
3单相LevelSet方法
3.1自由液面捕捉
定义LevelSet函数ϕ(流场任意一点到自由液面距离的函数,满足:
0iutϕϕ∂+⋅∇=∂(3
式中:
000ϕ<
⎧⎪=⎨⎪>
⎩
空气自由液面液体
通过插值获得0ϕ=(自由液面。
忽略空气和自由面表面张力的影响,则在自由面(0ϕ=处应满足如下条件:
0iijjiiuxnnxxϕϕ∂∂∂⋅=∂∂∂,=-(42zpFr
=(5单相LevelSet方法仅仅对船体流动的求解仅在0ϕ≤的计算域进行,空气相则是通过速度扩展(velocityextension的方法来流场速度。
因为只考虑单相流场,并且只需要在界面边界处稍加
4
处理,这样就成功避免了上述的两相流界面的过渡问题。
此外,在气体中,只需要布置少许网格来满足jumpcondition,因此相比twophase方法,计算资源的消耗则是大大减小,计算稳定。
单相level-set目前被广泛应用于空气和水的自由面问题当中。
4RANS控制方程与湍流模型
4.1控制方程
Reynolds模仿气体分子运动论里的平均概念,对不可压缩流体的NS方程进行时间平均,得到著名的ReynoldsAveragedNavierStokes(RANS方程。
不可压缩流体无量纲RANS方程的张量形式为:
0iiux∂=∂(7______
2_________'
'
1(0Reiiijijjijjjuuupuuutxxxxx∂∂∂∂∂++−−−∂∂∂∂∂∂=(8
5船舶六自由度运动求解
求解船舶的运动情况是采用求解运动方程来得到。
为此,我们首先要了解船舶在三个旋转轴的转动惯量。
如果我们将载体坐标系的原点定在船舶的旋转点位置上,那么三个方向的转动惯量就可以从(12式得到。
GG222,G222,G(y+z0000000(y+z0
000gxxygyzmrIImrI+⎡⎤⎢⎥=+⎢⎥⎢⎥⎣⎦G222,G0(y+zgzmr⎡⎤⎢⎥⎢⎥⎢⎥
+⎢⎥⎣⎦
(12式中,,gjr为j轴方向的惯量半径,GrotCGxxx=−为旋转点与重心位置纵向距离。
根据船体受力平衡,其刚体运动方程见(13-(14式。
船体运动后(船舶贴体网格部分,网格不需要重新生成,仅仅重新生成网格间的插值信息即可,船舶六自由度运动求解流程见图7,图8为典型单体船运动的网格示意图。
22CGiCGiCGiCGiidxddFmLIdtdtdtθ⎛⎞==⎜⎟⎝⎠(13
5
图3六自由度运动运动求解流程
图4动网格重叠示意图
6数值造波
规则波以及长峰或短峰不规则波可通过定义初始边界条件来实现,其在任意时刻的波幅可由(15式来表示,其为一系列不同波幅、波长和波向的简谐波线性叠加而成。
((,,coscossinij
i
j
ij
xytakxytξμμωφ⎡⎤=
−−+⎣⎦
∑∑
(15
ijφ为随机相位,ija
为波幅,iω=
ik为波数,jμ为入射角。
入射角包括
色散角jα和相对船的遭遇角0α,这样0jjμαα=+。
单元波波幅ija采用(16式求解。
ija=(16
(iSω为谱密度,可采用ITTC双参数谱、Bretschneider
谱、JONSWAP谱公式等。
([]22
cos22jjjD
-//
αααπππ
=
⊆,,为方向扩展函数(ITTC推荐公式。
在上述波浪初始条件下,则速度和压力的表达式见式(17:
(((0,0,0,(,,,coscossincos(,,,coscossinsin(,,,sincossin(,,,iiikzijjiijj
ij
kzijjiijj
ijkzijjiijij
iUxyztUkxytVxyztVkxytWxyztWkxytapxyztμμωφμμμωφμμμωφ⎡⎤=+
−−+⎣⎦⎡⎤=+−−+⎣⎦⎡⎤=+−−+⎣⎦=
(2,coscossin2iij
ijkz
kzijjiijiij
aekxyte
Frkμμωφ⎧
⎫⎡⎤−−+−⎨⎬
⎣⎦⎩⎭
∑
(17式中:
7静态计算验证
7.1单体船算例
采用重叠网格和单相LevelSet方法对DTMB5415和KCS约束船模在7
FrRe==×
和7
0.26,1.4010FrRe==×
分别进行了数值模拟,图9和表1分别为计算自由面形状和阻力与试验值的比较,可以看出结算结果与试验结果非常吻合。
≈。
计算无量纲时间步长0.01tΔ=,总时间10T=(其中加速段总时间12T=,船前进9倍的船长,计算平台为PCCoreQuadCPU2.33G+4.0GRAM,计算耗时15小时。
KCS计算网格状态为:
背景网格采用笛卡尔网格1384160×
×
物体贴体网格采用O型网格
1053961×
总数589275,计算未采用壁面函数,1.0y+≈。
计算无量纲时间步长0.01tΔ=,总时间10T=(其中加速段总时间12T=,船前进9倍的船长,计算耗时10小时。
图5DTMB5415andKCS自由面形状
表1阻力比较
4.32DTMB5415EXP
3.61KCSEXP
2.83(ITTC573.56Cal[本文]5.478
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