发酵法年产100吨T番茄红素项目可行性研究报告可编辑Word文件下载.docx
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d.提取;
e,制剂付型。
其特征是:
一级种子培养时,将保藏在土豆葡萄糖琼脂培养基斜面上能代谢产生番茄红素的三孢布拉霉两性菌种,分别接入装有种子培养基的三角烧瓶中,在24~30℃、160~180转/分钟条件下,进行振荡培养44~48小时;
种子经二级放大后,将分别培养好的三孢布拉霉两性菌种的种子发酵液按1∶1的比例混合后,接入发酵罐发酵生产。
在发酵过程中添加氧载体与代谢阻断剂,以提高产品的发酵单位,最终可使番茄红素含量达到1.5-2g/L。
采用工业化放大操作性强的溶剂提取工艺。
产品制剂付型时采用冷喷的工艺技术,加大限度的保留产品活性,延长保质期。
本项目的发酵水平在国内尚未有其他单位能实现,因而本项目关键技术的研发成功的彻底解决了国内番茄红素发酵生产的技术瓶颈。
其产业化符合国家组织实施生物医药高技术产业化专项的目标和要求,对于推进发酵工业中代谢调控研发水平的提高,促进传统天然植物营养提取物的产业升级,提高我国天然食品色素和功能性食品添加剂的产业核心竞争力具有重要意义。
项目总投资为7600万元,其中:
固定资产投资6736万元。
投产后形成年产100吨6%番茄红素的产业化规模。
达到年均营业收入10100万元,利润总额为5611万元,项目投资税后财务内部收益率为49.35%,税后静态投资回收期含建设期3.5年。
1.2.项目提出的背景与意义
1.2.1.产品性质、功能及作用机理1.2.1.1产品性质:
番茄红素又名ω-胡萝卜素,是一种开链式的不饱和胡萝卜素,为胡萝卜素和叶黄素生物合成过程中的中间产物,经两步环化反应后即为胡萝卜素。
1.2.1.2主要性质:
(1)分子式:
C40H56,分子量为536.88,针状深红色晶体(从二硫化碳和乙醇混合液中的析出物);
熔点:
174℃,可燃。
溶解性:
不溶于水,难溶于甲醇、乙醇,可溶于乙醚、石油醚、己烷、丙酮,易溶于二硫化碳、氯仿、苯、沸腾乙醚、正己烷等有机溶剂。
番茄红素的结构:
番茄红素大约有72种顺反异构体存在,植物中存在的番茄红素几乎都是反式的,而在动物体内则顺式占多数。
顺式异构体和反式异构体在物化性质上完全不同:
顺式异构体颜色弱、熔点低、消光系数小,在紫外光谱中有一个新的吸收峰;
反式结构耐热,熔点较高;
另外加工工艺也会造成其异构化。
全反式番茄红素是一种具有11个碳碳共轭双键的多不饱和脂肪族烯烃(见图1-1),溶于脂肪和油脂中并呈现红色。
由于具有非环状结构,故不表现维生素A的生理活性。
图1-1番茄红素的全反式结构番茄红素的稳定性:
番茄红素具有两大特点。
(l)易氧化性。
光照、温度、与氧接触、pH降低以及表面活性剂的作用均可使番茄红素发生降解;
酸对番茄红素具有较强的破坏作用,而碱的影响则不大;
(2)异构化性。
番茄红素有72种顺式异构体结构。
顺式结构与反式结构相比,物理化学性质的差异主要包括熔点的降低和消光系数的减小等,特别是消光系数的减小对于番茄红素的定量分析有一定的影响。
在储藏和制备过程中,番茄红素的损失主要是由于发生氧化异构化和降解,因此要在低温、暗处保存,尽量避光。
1.2.1.3生理功能及机理:
番茄红素是一种脂溶性类胡萝卜素,与β-胡萝卜素相比,它不是维生素A的前体,因而对番茄红素的早期研究主要集中在其热稳定性上。
后来,随着人们对番茄红素生理功能的进一步认识,其生理功能及生产方法的研究逐渐成为热点之一。
1989年DiMascio等发现番茄红素在所有的类胡萝卜素中具有最强的消除单线态氧的作用;
1999年MinhthyL等报道,与α-胡萝卜素、β-胡萝卜素相比,番茄红素对癌细胞的生长具有更强的抑制作用;
1995年Giovannucci等的研究表明通过食用大量含有番茄红素的食品(新鲜番茄、番茄酱等)可减少前列腺癌的发病率。
下面将对之进行详细介绍。
1高效猝灭单线态氧和清除自由基的作用与类胡萝卜素及其它抗氧化剂相比,番茄红素的抗氧化作用主要表现在它能高效猝灭单线态氧及清除过氧化自由基。
单线态氧1O2是一种很强的活性氧自由基,能跟许多与氧气不能发生反应的分子直接结合,从而造成对细胞的损伤。
番茄红素在猝灭单线态氧的过程中,激发态的能量从单线态氧转移至番茄红素,产生基态的氧和激发的三联态番茄红素,能量则通过激发态的番茄红素与周围溶剂之间的转动和振动而散发,并产生基态的番茄红素和一定的热量。
番茄红素对单线态氧的猝灭属于物理猝灭,番茄红素在这个过程中就像催化剂一样,只是加速其猝灭过程,而其本身保持完整状态,同时可不断参与下一个猝灭单线态氧的循环。
实验发现,番茄红素猝灭单线态氧的效率与其分子中所含有的共轭双键的数目有着密切的关系,番茄红素分子中有11个共轭双键,因此,与其它类胡萝卜素相比,番茄红素的猝灭效率特别高。
番茄红素还可以与其它形式的活性氧起反应,如:
过氧化氢、亚硝酸根等。
番茄红素作为抗氧化剂的一个很好的例子是它能保护皮肤免受紫外光的损伤,皮肤受到紫外光照射时,皮肤中的番茄红素能优先与自由基结合,从而保护皮肤中的组织及细胞避免了因氧化造成的损伤。
2防癌、抗癌作用1994年Franceschi等报道了食用大量的番茄可以防癌,1999年Giovannucci在其综述中提到番茄红素对肺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌等癌症均有抑制作用,能够在细胞水平上抑制神经胶质瘤细胞、白血病细胞的增殖作用。
美国哈佛药物学院和哈佛公众健康学院经过六年的时间分别对47894名男性作了详细研究,结果显示在46种水果和蔬菜中,只有番茄产品对前列腺癌具有可度量的抑制作用;
日本的一个医学研究所对4个胃癌发病率不同的地区进行调查,测定居民血浆中维生素A、B、C和β胡萝卜素、番茄红素的水平,发现血浆番茄红素的浓度越高,胃癌发病率越低。
虽然番茄红素对癌细胞繁殖的抑制作用在体外和动物的实验中均得以验证,但对于它具体的抗癌机理并不是很清楚,目前关于番茄红素的抗癌机理有:
猝灭单线态氧和清除自由基,防止其氧化损伤;
促进细胞间的正常结合;
抑制癌细胞增殖因子的作用;
活化免疫细胞的作用。
近年的研究表明,番茄红素与β?
胡萝卜素一样,是防治疾病的重要功能因子。
另外,番茄红素的许多具体功能有待进一步研究。
3防治血管硬化和冠心病作用流行病学、临床医学、以及生化研究表明血清中低密度脂蛋白(LDL)的氧化可能会造成动脉硬化,故抗氧化作用在一定程度上可减缓动脉硬化的进程。
番茄红素具有很强的抗氧化作用,它可以阻止低密度脂蛋白氧化物的形成,从而有效防治血管硬化;
同时,番茄红素也阻止DNA和脂蛋白的氧化作用,故它在防治动脉硬化疾病过程中起重要作用。
调查研究表明通过日常饮食所摄取的类胡萝卜素对减小冠心病的发病率和死亡率起重要作用,而且血清和脂肪组织中番茄红素的浓度和患冠心病几率呈负相关关系。
荷兰学者对心肌梗塞患者的检查中发现病人的番茄红素含量低于健康人,而且α和β胡萝卜素含量也比正常人体显著降低,以上这些均说明番茄红素对防治血管硬化和冠心病具有重要作用。
4在人体内的存在及其吸收特性β-胡萝卜素和番茄红素是人体组织和血液中存在的主要类胡萝卜素。
人体内的番茄红素不仅以全反式结构存在,还以9-顺、13-顺、15-顺的形式存在。
有报道表明,人类从外界摄取番茄红素的过程中,用1%的玉米油热处理1小时的番茄汁要比未经处理的番茄汁易于吸收,这可能是由于番茄红素是脂溶性类胡萝卜素以及热处理会破坏细胞壁的结构,增强番茄红素的生理活性;
而且他们还发现服用热处理过的番茄汁24-48小时后,人体血清中番茄红素的浓度达到峰值,但食用未经处理的番茄汁则不会出现上述现象。
这些现象说明,经过处理的番茄红素制品更有利于人体的吸收。
1.2.2.产品用途、市场概况1.2.2.1产品用途国外番茄制品除传统的番茄酱(Tomatosauce)、番茄汁(Tomatojuice)外,现在向功能性生物制品发展,番茄红素主要被运用于如下几个方面。
1用于防止紫外线灼伤,保护皮肤的产品上
商品名LYC-O-MATO
Sunscreenfactor8#SolarHealthClearComplexinLifessentialSinEhanceSeresisCellProtection
主要成分Lycopene、VA、VELycopene、β
-Caroten、Grapeseed、
Bioflavonoids、Zn、VE、VCZn、Lycope。
β-Carotene、VE
用途(UVA、UVB)灼伤健肤健肤、润肤
生产商UltimatePharma
ProductsBullivant’sNatural
HealthProductsPty.LtdBullivant’sNatural
HealthProductsPty.LtdKordedPty.Ltd.PharmationNaturalHealth
Products
国别以色列澳大利亚澳大利亚澳大利亚瑞士
备注是以一种油树脂(Oleoresin)的形式提供或其胶囊,能够较好的被人体吸收。
表1-1国际市场番茄红素护肤用品2用于预防前列腺癌的产品主要有一下几个公司出产:
Twinlab、Jules、MetaPham、WakunageofCO.Ltd,典型产品有:
LycosoyPostrateProtector(60粒胶囊)Twinlab(美国);
ProstateHealth(90粒胶囊)Jules(美国);
Duo?
Confort(40粒软胶囊)MetaPham(法国);
KyolicProsta?
Logic(60粒胶囊)WakunageofgmericaCO.Ltd.(美国);
Jarrowprostateoptimizer60粒胶囊JarrowFormulasInc3用于番茄红素功能性产品生产这类产品的厂家很多,产品类型也较多,这类产品已得到FDA的认证。
国际著名公司共有五家,分别是:
JarrowFormulasInc;
Nature’sHerbs;
Twinlab;
Naturals;
LyoRed。
4用于类胡萝卜素复合产品
该类产品主要与α-、β-胡萝卜素、叶黄素合用于功能食品,为Solgar公司出品,主要产品如下:
LycopeneCarotenoidComplexVegicaps(15mg,30粒胶囊)Solgar;
SawPalmettoPygeumLycopeneComplexVegicaps(4mg50粒胶囊)Solgar营养品或保护前列腺;
LuteinLycopeneCaroteneComplexVegicaps(5mg,30粒胶囊)Solgar抗氧化剂。
其实早在20世纪50年代,美国的科学家就首次报道番茄红素具有抗癌功效。
2001年由美国瑞琦生物科技实验室(RICHLIFELABS)和美国加洲癌症预防研究中心领导的科研小组研制的口服复方番茄红素片(LycopenePlus~来托康)顺利通过FDA认证,在欧美地区再次掀起了更大的“红色风暴”。
“来托康”突破了传统的生产工艺极限,是番茄红素产品发展过程的一场革命,它的番茄红素含量为6mg/片,是近乎一筐新鲜番茄所能提取出的数量。
番茄红素作为天然色素已在全世界范围内被广泛接受,但由于对天然色素这一概念的界定存在差异,各国间并无统一的尺度。
欧共体很早以前就允许使用番茄红素,但仅限于天然的番茄红素作为食品着色剂。
由于其在各种植物体内含量均较低,故而一直未能商业化生产。
日本也有一种商品番茄红素,Lycopene含量为5土0.25%,为红褐色液体。
目前最大的生产高含量番茄红素的西红柿提取物的工厂位于以色列,他们的产品是纯天然的,可以作为营养补充剂和食用色素。
目前对番茄红素提取物的商业品质通常要求Lycopene含量>
3%。
90-95%纯品番茄红素,其出口售价约人民币5000万元/t,以色列的报价为6000美元/kg。
1.2.2.2市场概况目前番茄红素产品主要销往欧美等国,年需求量超过1000吨。
有多家代理商代理该产品的出口。
5%含量的产品价格约为150万元/吨。
1.2.3.项目的意义与必要性
1.2.3.1对上游医疗保健品的推动作用番茄红素具有独特的长链分子结构和比其它类胡萝卜素多的13个双键,因而具有较强的抗氧化能力,是类胡萝卜素中淬灭单线态氧和引起衰老、病变的自由基能力最强的一种色素,其生理活性是VE的100倍,β-胡萝卜素的2倍,同时番茄红素还具有细胞间信息感应和调控细胞生长的作用,具有抑制低密度脂蛋白的氧化和抗紫外线作用,是一种新型的功能性天然色素。
该产品上市后,可增加治疗、预防癌症的可选药物,对于医疗卫生事业的发展有着积极影响。
并且该产品来源于天然,无不良副作用,不同于现行的癌症治疗药物,代表着一种治疗药物发展方向。
对相关天然色素行业的发展带动作用过去天然色素是天然植物提取物的一种。
天然植物营养物的提取,破坏着大量的植物、森林资源,可供种植的营养物质的提取又存在与粮争地,与人夺食的客观现实。
在2008年爆发世界性粮食危机以来,已经向以消耗粮食资源为代价的生物能源、生物材料、生物化工行业敲响了警钟。
本项目采用微生物发酵法生产番茄红素,不与粮争地,而且节约了为提取番茄红素而用于种植番茄的土地,其产业的实施,必然推动天然植物提取业发展,提出以不破坏资源为途径的可持续发展的新道路。
推动天然色素化合物平台建设,加速天然色素产业化天然色素是指天然动、植物中的有色化合物。
由于来源于生物体,天然色素色泽逼真,安全性高,而且有的天然色素除具有着色功能外,还兼有重要的生物功能。
利用微生物发酵生产天然色素,生产周期短、不受场地和季节限制,已引起了人们的广泛重视。
微生物生产天然色素是生物技术领域的新兴产业,但是许多产业技术尚不完善,成套的加工工艺尚待解决。
本项目实现后将组建国内首家专业利用微生物生产天然色素的技术平台,创立完整的微生物生产、提取、分离、纯化天然色素及其制剂成套工艺。
打造出一个具有国际竞争力的色素企业,以天然色素的基础理论及应用技术研究为企业发展的核心竞争力,推动国内天然色素产业化进程。
1.3.研究的结论及建议
番茄红素是一种新兴的天然功能性色素,具有延缓衰老,防癌抗癌的保健作用;
其步入市场后可以提高人们生活质量,预防疾病;
并且该项目利用大发酵法生产,不依赖于自然资源,不破坏环境,不与粮食竞争,比直接提取法,。
化学合成法更具节能、环保的优点。
该项目采用代谢调控的办法,大大提高了发酵水平,其产量可与国际同行比肩,生产成本低廉,产品竞争力高。
项目采用的环保治理,安全卫生,消防设施完善、合理,建成后对当地生态和环境不会构成太大冲击。
2、技术先进性
2.1.传统生产工艺及存在的问题由于番茄红素具有卓越的防癌、抗癌以及防治心脑血管疾病的功能,研究人员在深入研究其治病机理的同时,也在致力开发番茄红素的生产工艺。
迄今为止,已见于报道的生产工艺主要有天然提取法、化学合成法和微生物发酵法。
2.1.1.天然提取法天然提取法主要是利用番茄红素的脂溶性性质,从富含番茄红素的植物中提取而获得产品。
提取方法主要包括有机溶剂提取法、微波萃取法、直接粉碎法提取、超临界CO2萃取法及酶法。
但由于番茄中所含番茄红素较低(10mg/100g),即使是我国产量最丰富的新疆地区所生产的番茄也只含有20mg/100g左右,因而天然提取法价格昂贵、产率低、受产地及季节限制,无法满足市场需求
2.1.2.化学合成法化学合成法生产番茄红素较成功的主要是德国的罗氏公司和巴斯夫公司。
1997年10月,罗氏公司完成了工艺开发并在欧洲提出专利申请。
该工艺由三苯基氯化磷和辛三烯二醛用甲醇在2-丙醇中进行烯化反应,制得番茄红素的收率为65%。
罗氏公司将在瑞士的一个生产基地用合成工艺批量生产番茄红素,并用罗氏开发的微囊技术,微囊化工艺生产不同的番茄红素制品。
德国巴斯夫公司也看到了番茄红素不可估量的市场潜力,投入力量进行研究开发,1997年8月完成了合成工艺开发,并在欧洲提出专利申请。
该工艺由三苯基甲磺化磷与辛三烯二醛反应制得番茄红素,产品已面市。
该法虽已实现工业化,且价格便宜,但随人们对绿色食品的要求逐渐趋于不利地位,目前该法生产的番茄红素主要用作饲料。
2.1.3.微生物发酵法由于番茄中的番茄红素含量较低(10mg/100g),即使是新疆产的也只有20mg/100g左右,且天然提取法价格昂贵、产率低,无法满足市场需求。
因而利用微生物发酵法生产番茄红素一直是国内外研究的热点之一。
微生物发酵法主要是利用藻类真菌、酵母菌S.cerevisiae、酵母菌Candida.Utilis、Escherichiacoli菌、毛霉属菌Phycomyces、Blakesleatrispora、Choanephora以及基因工程菌等微生物发酵生产番茄红素。
迄今为止,能够生产番茄红素的微生物包括能自身合成番茄红素的革兰氏阴性菌(Erwiniauredovora和Erwiniaherbicola),毛曲霉属(如三孢布拉氏霉菌Blakesleatrispora、Phycomyces、Choanephora)、酵母菌以及基因工程菌。
其中Blakesleatrispora是研究最多,也是目前唯一能够实现胡萝卜素工业化生产的菌株,本项目就是采用此菌种作为番茄红素的生产菌。
2.2.生产工艺发酵法生产番茄红素所用的菌有基因工程菌和三孢布拉氏霉菌,采用基因工程菌发酵法生产番茄红素的方法现仍处于小试水平,且产量很低,距工业生产尚有很大距离。
三孢布拉氏霉菌(B.trispora)在工业上用于β-胡萝卜素的生产,目前报导的发酵单位可达3.5g/L发酵液。
人们对β-胡萝卜素的代谢途径进行了系统的研究,发现三孢布拉氏霉菌主要通过甲羟戊酸途径合成β-胡萝卜素,具体代谢途径如下:
图1三孢布拉氏霉菌中类胡萝卜素合成途径
根据β-胡萝卜素的代谢途径,番茄红素是其生物合成的中间代谢产物。
因而,如能在发酵过程中阻断番茄红素向β-胡萝卜素的环化反应,即可得到番茄红素。
以此为基础,俄罗斯科学家Gavrilov等开发了利用烟草废弃物阻断番茄红素向β-胡萝卜素的转化以制备番茄红素的工艺,番茄红素发酵单位为760mg/L。
本课题组对用三孢布拉氏霉菌发酵生产番茄红素进行了系统的研究,通过菌种选育得到了高产菌株,通过发酵条件优化使番茄红素发酵单位达1026mg/L。
主要工作如下:
2.2.1.建立了三孢布拉氏霉菌筛选、诱变程序三孢布拉氏霉菌(B.trispora)是一种丝状真菌,在平板上培养时,菌丝在生长初期迅速蔓延至整个平板,无法进行分离。
根据文献报道[1],B.trispora在传代过程中极易发生高表达能力的缺失,菌体退化,而且退化特征会向正常菌株发生不可逆传递。
鉴于此,建立一套简易快捷的菌种筛选、诱变程序具有重要的意义。
在研究中通过向培养基中添加适宜浓度的脱氧胆酸钠,建立了适合B.trispora的筛选培养基;
在总结大量实验的基础上,制定了根据菌体形态所获得的高产菌株的筛选标准,建立了筛选程序,并对筛选结果进行了验证;
采用化学法与物理法相结合的方式对Btrispora-菌进行诱变处理,建立了一套适合于-菌的诱变程序,为获得稳定的番茄红素高产菌株提供了技术基础。
2.2.2.研究了阻断剂的添加对产番茄的影响
阻断剂添加降低了甲羟戊酸途径的代谢通量进而降低了番茄红素的发酵单位:
我们在研究过程中发现,同一株菌,在最优条件下,其β-胡萝卜素的发酵单位可达3.5g/L,但添加阻断剂后,菌丝体干重基本不变,番茄红素的发酵单位却仅为1026mg/L。
说明阻断剂的添加,不仅阻断了番茄红素向β-胡萝卜素的转化,同时也对其原有代谢途径产生影响,降低了番茄红素的代谢通量,使番茄红素的发酵单位降为β-胡萝卜素生产能力的1/3。
Gavrilov等的研究结果也证明了我们的推断。
2.2.3.代谢调控研究
麦角固醇旁路代谢降低了番茄红素的代谢通量:
我们在研究过程中发现加入角鲨烯合成酶抑制剂特比萘酚等化学阻断剂可以减少麦角固醇的合成,促进代谢流向番茄红素方向迁移,进而增加番茄红素的产量。
干菌体中麦角固醇的含量减少了16.7%,干菌体中番茄红素含量则提高了23.78%。
说明在分支点处降低角鲨烯合成酶的活性,可促使代谢流向聚异戊二烯基焦磷酸迁移并最终促进番茄红素的合成。
2.2.4.溶氧水平对产番茄红素的影响
溶氧水平不足降低了番茄红素的发酵单位:
三孢布拉氏霉菌为耗氧真菌,且代谢旺盛,生长速度快,产物合成过程中对氧气消耗大,本实验室研究表明番茄红素的发酵单位随溶氧水平的增加而增加。
因此,解决发酵过程中氧气供应是三孢布拉氏霉菌发酵中亟需解决的问题。
在研究中我们筛选得到了适用于三孢布拉氏霉菌的氧载体,通过添加氧载体以增大溶氧水平,进而提高了番茄红素的发酵单位。
2.2.5.RNA干扰技术平台的建立
迄今为止,利用RNAi技术沉默番茄红素环化酶的基因以及将角鲨烯合成酶抑制剂用于阻断麦角固醇途径以促进番茄红素合成的研究尚未见有报道。
本课题组近年来利用现代分子生物学技术及医学领域的研究结果,依据代谢工程原理,对通过代谢调控以大幅度提高番茄红素的发酵水平进行了系统的研究,取得了以下创新成果:
番茄红素环化酶基因的RNAi技术:
利用高效、特异性的RNAi(RNAinterference)技术沉默番茄红素环化酶基因,代替阻断剂的添加,从而达到了提高番茄红素发酵单位的目的。
通过上述研究,我们已成功地开发了发酵法生产番茄红素的新工艺,在500L发酵罐中中试成功,技术成果经北京市科委组织坚定,达到国际先进水平,并申请了发明专利(已公开),产品经中国农科院检测,超过国外同类产品标准。
2.3特点及优势
利用三孢布拉氏霉发酵生产番茄红素主要通过添加番茄红素环化酶的抑制剂(烟草)来实现,但烟草的添加降低了类胡萝卜素的代谢通量,番茄红素的发酵单位也大幅度降低。
至
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