质粒DNA的提取文档格式.docx
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1、将菌液移入1.5ml离心管,离心30秒(13000rpm),倒去上清液,如收集3ml菌液,重复一次,倒转于滤纸除净残液。
2、加入100μl预冷的溶液Ⅰ(含5ug/μlRNAase),用涡旋震荡器充分悬浮。
3、加入150μl溶液Ⅱ,快速颠倒温和混匀,室温放置5分钟。
此时溶液应非常粘稠。
4、加入150μl预冷的溶液Ⅲ,温和混匀(此时应有可见沉淀),在冰浴中5分钟。
5、12000rpm离心3分钟。
转移上清液至另一1.5ml离心管中。
6、加800μl乙醇到上清液中,混匀,12000rpm离心5分钟,除去上清(尽可能除去残液)。
7、用0.5ml70%乙醇洗DNA沉淀一次,离心2分钟,除去乙醇(尽可能除去残液)。
8、离心干燥DNA。
9、加40μlTE溶解DNA,待用(或-20℃保存)。
五、实验总结
本次实验的结果主要呈现在电泳中。
这里提出几点需要注意的地方。
1、质粒DNA的提取应该保持动作轻柔。
2、多次离心时将同一侧朝向外边可以让沉淀聚集在一起。
琼脂糖凝胶电泳法检测DNA
学习琼脂糖凝胶电泳,检测DNA的纯度,DNA的构型,含量以及分子量的大小。
琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中最常规的实验方法,它简单易行,只需少量的DNA就能检测。
其原理是溴化乙啶在紫外光照射下能发射荧光,当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时,琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物;
使得DNA发射的荧光,增强几十倍。
而荧光的强度正比于DNA的含量,如将已知浓度的标准样品做琼脂糖凝胶电泳的对照,就可比较出待测样品的浓度。
电泳后的琼脂糖凝胶块直接在紫外光下照射拍照,只需5~10ngDNA,就可以从照片上比较鉴别。
如肉眼观察,可检测到0.01~0.1ng的DNA。
在凝胶电泳中,DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应,前者由分子所带净电荷的多少而定,后者则主要与分子大小及构型有关。
DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷。
在电场中向着正极移动,在用电泳法检测DNA分子时,应当尽量减少电荷效应。
增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应,使得分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度差异所决定,提高分辨率。
同时适当降低电泳时的电压,也可以使分子筛效应相应增强而提高分辨率。
当然也可以用同样的方法检测RNA。
三、试剂与主要仪器
(一)试剂
1、DNA样品(第一次是GFP和P38质粒的DNA)
2、TBE缓冲液(5×
):
用时需稀释10倍(配制见附录)
3、点样缓冲液Loadingbuffer(10×
0.25%溴酚蓝,40%甘油
4、溴乙啶(EB):
10mg/ml溴乙啶注意:
该试剂具致癌作用,用时要小心。
5、琼脂糖
(二)仪器
1、电泳仪系统
2、紫外灯
3、恒温水浴箱
1、选择合适的水平式电泳仪,调节电泳槽平面至水平,检测稳压电源与正负极的线路。
2、选择孔径大小适宜的点样梳,垂直架在电泳槽负极的一端,使得点样梳的底部与电泳槽水平面的距离为0.5~1.0mm。
3、制备琼脂糖凝胶:
按照被分离的DAN分子的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量。
一般情况下可参考下表:
琼脂糖的含量(%)
分离线装DNA分子的有限范围(kb)
0.3
60~5
0.6
20~1
0.7
10~0.8
0.9
7~0.5
1.2
6~0.4
1.5
4~0.2
2.0
3~0.1
称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中,一般配制约40ml凝胶液,置微波炉中或水浴加热,至琼脂糖融化均匀。
4、将凝胶槽洗净擦干,两端用胶布封好,并在一端插好梳子。
待凝胶溶液冷却至60℃左右时,在凝胶溶液中加EB(EB最终浓度为0.5微克/毫升),摇匀,(此步骤改为电泳后在EB中浸泡五分钟)轻轻倒入电泳槽水平板上,除掉气泡。
待凝胶完全凝固后,去掉两端封条,将凝胶槽移至电泳槽(槽中已加入TBE缓冲液),然后小心地拔掉梳子保持点样孔完整。
注意:
缓冲液要高出凝胶面2㎜。
5、待测的DNA样品中,加入1/5体积的点样缓冲液,混匀后小心的进行点样,记录样品点样顺序和点样量。
6、开启电源开关,最高电压不超过5V/cm。
7、泳时间看实验的具体要求而异,在电泳中途可用紫外灯直接观察,DNA各条区带分开后电泳结束。
一般20分钟至3小时,取出电泳凝胶块直接检测拍照。
五、实验结果及讨论
凝胶电泳成像系统结果(但是我不记得是哪条带了...)
那就就这个图进行一下说明
从左向右第八条带显然是Marker,Marker左边是P38右边是GFP。
有一个问题:
书上说最高电压不超过5V/cm,但是用的电压是150V显然超过了这一数值,会产生什么影响?
我记得生化实验说这会导致条带变宽。
而且如果电压大会导致过热,使得核酸变性。
质粒DNAPCR、酶切及琼脂糖电泳分析鉴定
1、学习PCR反应的基本原理和实验技术。
2、了解引物设计的一般要求。
3、学习质粒的酶切及电泳分析。
PCR
聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)是体外酶促合成DNA片段的一种技术。
利用PCR技术可在数小时之内大量扩增目的基因或DNA片段,以用于基因工程操作。
PCR进行的基本条件:
DNA模板(在RT-PCR中模板是RNA)
引物
dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)
TaqDNA聚合酶
反应缓冲体系
PCR循环由三个步骤组成:
变性使模板DNA解离成单链;
退火使引物与模板DNA所需扩增序列结合;
延伸DNA聚合酶利用dNTP合成与模板碱基序列互补的DNA链。
每一个循环的产物可作为下一个循环的模板,通过30个左右循环后,目的片段的扩增可达106倍。
引物设计:
要保证PCR反应能准确,特异,有效的对引物DNA进行扩增,通常引物设计要遵循以下原则:
引物长度:
15~25个核苷酸;
GC含量为40%~60%;
Tm值为55℃(Tm=4(C+G)+2(A+T)计算;
引物与非特异配对位点的配对率小于70%;
引物自身配对形成的茎环结构,茎的碱基对小于3,
两条引物间配对碱基数小于5个。
由于影响引物的设计的因素比较多,所以常常利用计算机来辅助设计。
本实验以实验二中提取的质粒DNA为模板,进行PCR扩增,大量得到目的DNA片段。
酶切
限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点,并产生特异的切割,形成粘性末端或平末端,这样有利于DNA片段再连接。
限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点,酶切后就能产生多少个片段。
因此,鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数,就可以推断切点的数目;
从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。
用已知相对分子量DNA为对照,通过电泳迁移率的比较,可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。
质粒DNA在细胞内有三种构象:
共价闭环DNA,常以超螺旋形式存在;
如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成开环DNA;
线状DNA,双链DNA断开成线状。
电泳时,三种构象中,共价闭环DNA迁移率最大,其次是线状DNA和开环DNA。
因此在本实验中,质粒在电泳中呈现2~3条区带。
1、TaqDNA聚合酶
2、10×
反应缓冲液(含25mmolMgCl2)
3、dNTP
4、引物(P1、P2)
5、溴乙啶(EB):
10mg/ml溴乙啶。
注意:
6、点样缓冲液Loadingbuffer(10×
0.25%溴酚蓝,40%甘油。
1、PCR扩增仪
2、电泳仪
3、台式离心机
4、紫外分析仪
5、恒温水浴
6、凝胶成像系统
1、EcoRⅠ酶
2、P36质粒DNA
3、TBE缓冲液(5×
用时需稀释10倍
4、点样缓冲液Loadingbuffer(10×
5、溴乙啶(EB):
10mg/ml溴乙啶注意:
6、琼脂糖
1、电泳仪系统
2、紫外灯
3、恒温水浴箱
(一)PCR扩增
1、按下表加入试剂,并小心混匀。
模板为实验一中提取的质粒DNA。
试剂
体积(50μl)
ddH2O
31.5μl
10xbuffer
5μl
10×
dNTP
PrimerP1
1μl
PrimerP2
模板
Taq酶
0.5μl
2、设置PCR程序:
94℃180s
94℃45s
30cycles:
55℃45s
72℃60s
72℃600s
3、运行PCR程序
(二)PCR产物鉴定
反应结束后,取20μlPCR产物进行1.2%琼脂糖电泳分析。
(一)质粒DNA酶切
管号
质粒DNA
10
EcoRⅠ/μl
1
酶切Buffer(10×
)/μl
2
ddH2O/μl
8
7
6
RNA酶
1、按下表将各种试剂分别加入每个Eppendorf管中,要注意管号。
2、加样后混匀,置于37℃水浴中,保温2小时。
然后每个管中加入4μlLoadingbuffer。
(二)琼脂糖凝胶电泳
1、琼脂糖凝胶的制备
称取0.4g琼脂糖加入40ml0.5×
TBE缓冲液中,加热熔解。
冷却至65℃时加入2μlEB,混匀。
2、胶板制备
将凝胶槽洗净擦干,两端用胶布封好,并在一端插好梳子。
然后倒入熔好的琼脂糖,待凝胶完全凝固后,去掉两端封条,将凝胶槽移至电泳槽(槽中已加入0.5×
TBE缓冲液),拔掉梳子。
缓冲液要高出胶面2毫米。
3、加样
每个样品中加入1/10体积点样缓冲液,混匀后小心地加入样品槽中,要避免相互污染。
4、电泳观察
接通电源,电压为80V,电泳1小时左右,当溴酚蓝到达下沿1--2㎝处时,停止电泳。
5、观察及照相
将胶板拿出,用自来水小心地冲洗一下。
在紫外灯下观察结果,如果有条件也可用凝胶成像系统照相。
5、实验结果及讨论
质粒酶切、PCR产物的电泳结果,可以看到质粒DNA分子量很小。
植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析
掌握植物基因组DNA提取的一般方法及注意事项。
大分子量DNA分子的酶切分析。
十六烷基三乙基溴化胺(CTAB)是一种去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度时,从溶液中沉淀。
在本实验方案中,首先通过含有CTAB高盐抽提液使DNA充分溶出,然后加入氯仿使蛋白和细胞碎片沉淀,离心后,溶液分为三层,上层为CTAB与核酸的复合物的高盐溶液,中层为蛋白质和细胞碎片,下层为氯仿。
取出上清加入异丙醇使核酸沉淀。
由于CTAB能溶解于乙醇,在洗涤过程中CTAB即可被除去。
小麦幼苗
1、DNAextraction:
500ml
31.885gsorbitol(山梨醇)
6.05gtrisPH8.2(一般不调)
2、Nucleilysisbuffer:
500ml
100ml1MTrisPH7.5
100ml0.25MEDTA
200ml5MNaCl
10gCTAB
100mlddH2O
3、5%sarkosyl(N-月桂酰肌氨基钠盐)500ml
用时,将上述三种溶液按1:
1:
0.4比例混匀,加入亚硫酸氢钠(3.8g/l),即为抽提液。
4、氯仿:
异戊醇(24:
1)
5、70%乙醇
6、异丙醇
7、HindⅢ酶
8、EcoRⅠ酶
(三)器材
1、台式离心机
2、恒温水浴
3、紫外分析仪
4、微量加样器
(一)基因组DNA提取
1、取0.15g左右小麦叶片,在液氮中研磨后放入1.5ml离心管中,加入700μl抽提液(65℃预热)混匀,放入65℃水浴中,裂解40-60分钟,期间温和混匀几次。
2、取出裂解好的DNA,加入700μl氯仿:
1),猛烈混匀,离心(10000rpm,10分钟)。
3、取上清于新管中,(不要混入氯仿),加入0.8-1倍预冷异丙醇,缓慢混匀后,再猛烈混匀,使DNA成团,-20℃放置半小时以上。
4、将析出的DNA离心,14000rpm,10分钟。
5、去掉上清,将沉淀用1ml70%乙醇清洗一次,离心干燥,溶于50μlTE或水中。
(一)酶切及电泳分析
1、按照下表加入各成分。
3
4
gDNA
30μl
λDNA
3μl
EcoRⅠ
1.5μl
HindⅢ
BUFFERH
2μl
BUFFERE
Rnase
13.5μl
14μl
1、10000rpm离心20S混匀,37℃反应4h。
2、0.8%琼脂糖凝胶电泳(样品全部点样)。
3、观察并记录结果。
电泳分析结果如下
基因组PCR产物电泳基因组酶切产物电泳
RNA提取与纯化
掌握RNA提取的基本技术,了解RNA提取过程中的各种注意事项。
RNA提取是分子生物学实验中难度较大的实验技术。
RNA提取和DNA提取有类似的地方,因为它们都是核酸,都具有较好的水溶性。
提取RNA首先破碎细胞,然后用提取液将RNA溶出,反复抽提去除蛋白质,加入乙醇沉淀RNA,将RNA沉淀溶解备用。
那么如何区分DNA和RNA分开?
DNA和RNA的溶解性不同,DNA在1M的盐溶液中具有最好的溶解度,而RNA在0.14M的盐溶液中具有最好的溶解度,所以可以利用它们的溶解性将它们进行区分。
另外,RNA的分子量一般比较小,而DNA分子很大且和蛋白结合成复合体,所以DNA更容易随蛋白沉淀,而RNA具有较好的溶解性。
RNA提取的另一个关键问题就是如何抑制或去除环境中RNA酶。
所有的玻璃、陶瓷和铁器具在180℃烘烤6小时以上。
所有的塑料器皿用0.1%的DEPC水37℃过夜浸泡,然后湿热灭菌80℃烘干备用。
配制溶液所需的水也要用DEPC处理过的水,而配置Tris相关的缓冲液时Tris会与DEPC发生反应,应避免用DEPC处理。
另外操作过程中应戴手套。
判断RNA的质量主要有两个标准,一是纯度,二是完整性(是否被降解)。
RNA的纯度可以通过分光光度计进行测定的A260/A280值来判断。
RNA的完整性主要通过电泳分析来阐明,未降解的总RNA电泳时在凝胶中会出现18S和28SrRNA对应的条带(如果有DNA污染则在RNA后会发现基因组DNA对应的条带)。
RNA电泳系统也要严格对RNA酶进行处理。
如果用普通琼脂糖凝胶电泳,则用尽量减少电泳时间。
三、试剂与器材
1、暗培养7天的小麦苗,用前光照诱导3小时
2、DEPC
3、DEPC处理的ddH2O
4、RNA提取液:
(每1000毫升中含有)
Tris6.06克(最终浓度为50mM)
LiCl6.03克(LiCl-H2O9.06克)(最终浓度为150mM)
EDTA(0.5M)10毫升(最终浓度为5mM)
SDS50克(最终浓度为5%)
5、8MLiCl:
33.92克LiCl溶于100mlDEPC处理的ddH2O
6、水饱和酚
7、氯仿
8、0.5MNaCl
9、溴乙啶(EB):
10、点样缓冲液Loadingbuffer(10×
二、器材
1、电泳仪
2、台式离心机
3、恒温水浴
4、凝胶成像系统
1、取植物叶片1-3克,放在液氮中磨成粉末。
(可以多研磨一些,然后分装,小量提取试剂量可减至1/10)
2、液氮挥发完之前,倒入含有10毫升RNA提取液的离心管中,迅速反复倒置混匀,直至看不见任何团状物为止。
3、立即加入10毫升的等体积(酸性)酚/氯仿,剧烈(!
)反复倒置混匀5至10分钟(如在震荡器上震荡,要确保混匀而不能仅仅是振动!
)。
4、13000g离心5分钟,吸管取上清(注意避免吸取界面上的蛋白)。
5、重复步骤3和4,三次左右(注意观察界面上白色物质)。
6、取上清,加入等体积的氯仿,反复倒置混匀2-5分钟。
7、13000g离心5分钟。
8、取上清,加入1/3体积8M的LiCl(即8MLiCl应占最后体积的25%),沉淀RNA,4℃过夜。
9、离心13000g×
10分钟。
10、弃上清,保留沉淀(此时应把RNA沉淀转入Eppendorf管中,以便于操作),加入70%无水乙醇+30%0.5MNaCl的混合液0.5毫升洗涤沉淀数分钟(和缓地反复倒置混匀),离心(13000g×
2分钟)。
重复洗涤沉淀数次。
11、用70%乙醇再洗涤2次沉淀,去掉盐离子。
12、用枪头吸去残留的液体,真空干燥2分钟。
13、加入200ulDEPC处理过的水溶解RNA。
14、取用5ul电泳检测RNA完整性,用TEB缓冲液,200V,走20-30分钟。
15、取5ul稀释40倍测定RNA的纯度和浓度,A260nm/A280nm应在2.0左右。
16、将RNA分装,放在-70℃长期保存备用.
辅助方案:
试剂盒提取法(SK361)
(一)试剂:
1、RLTSolution
2、RWSolution
3、RPESolution
4、DEPC-Water
5、Ethanol(100%)
(二)器材:
1、UNIQ-10Column
2、2.0mlCollectionTube
3、离心机
4、移液器
(三)实验步骤
1、称取小麦叶片0.2g,于研钵中加液氮研磨成粉末,迅速转移到1.5ml离心管中。
2、迅速加入450μlRLTSolution,剧烈振荡,使样品充分溶解。
3、加300μl无水乙醇,温和混匀。
4、将UNIQ-10Column套到2mlCollectionTube上,将上述溶液转移到UNIQ-10Column中,10000g离心1min。
倒掉CollectionTube中的溶液,重新将UNIQ-10Column套到2mlCollectionTube上。
5、加入500μlRWSolution到UNIQ-10Column中,10000g离心1min。
6、加入500μlRPESolution,10000g离心1min。
倒掉CollectionTube中的溶液,重新将UNIQ-10Column套到一个无菌的新1.5ml离心管上。
7、加40μlDEPCWater到UNIQ-10Column中,50℃温浴2min,10000g离心1min,收集到的溶液即为RNA溶液。
8、测定RNA的浓度和纯度。
(四)实验结果与讨论
RNA电泳结果
讨论
1.RNA较DNA更加容易破碎,操作应更加轻柔。
2.所有直接接触样品的物品都应该经过处理去除RNA酶
3.操作过程应尽量的快。
4.本次实验的RNA就有几组电泳条带较弱,因为上述操作未能严格遵守所致。
5.对比RNA、植物基因组、原核生物质粒DNA提取的异同。
第一,提取剂不同。
RNA使用Trizol,植物基因组DNA使用DNA抽提液(山梨醇、EDTA、NaCl、CTAB、sarkosyl),质粒DNA用的是溶液I、II、III(EDTA、Tris-HCl、乙酸甲、SDS等)
第二,离心速度不同,不过差别不太大。
第三,都是经过两次离心分离,一次取上清,再一次弃上清。
反转录聚合酶链反应(RT-PCR)
学习从细胞或组织的RNA中用逆转录PCR扩增目的基因的技术及操作。
普通PCR方法可以以DNA为模板扩增基因,但真核生物的基因中大多包含内含子,所以从染色体DNA为模板扩增出的基因是内含子和外显子相间排列的DNA分子,不能用于基因工程的直接
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